6.5  Phương pháp huyết thanh học Ag-ELISA phát hiện kháng nguyên vòng của Taenia spp.

Hiện nay có một số bộ kít ELISA phát hiện kháng nguyên vòng của Taenia spp. có bán sẵn trên thị trường. Thực hiện phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục G).

CHÚ Ý: Phương pháp này chỉ đặc hiệu cho giống Taenia spp., không đặc hiệu loài nên chỉ dùng trong điều tra dịch tễ để sàng lọc.

7  Kết luận

Lợn được kết luận là mắc bệnh gạo lợn, bò được kết luận là mắc bệnh gạo bò khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm kháng nguyên dương tính bằng một trong những phương pháp sau:

- Phương pháp cắt lát cơ;

- Phương pháp nhuộm Haemotoxylin và Eosin;

- Phương pháp PCR-RFLP.

...

...

...

(Quy định)

Cách pha dung dịch PBS pH 7.0

Natri hydrophotphat (Na₂HPO₄)

9,47 g

Kali dihydrophotphat (KH₂PO₄)

9,08 g

Nước cất

900 ml

Hòa tan Natri hydrophotphat (Na₂HPO₄), Kali dihydrophotphat (KH₂PO₄) và lắc tan hết. Điều chỉnh để dung dịch đạt pH = 7 ± 0,2.

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Xử lý mẫu trong phương pháp nhuộm Haemotoxylin và Eosin

Ngâm khuôn nhựa (4.1.1) đựng mẫu trong Ethanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm trong Ethanol 90 % (thể tích) (3.1.2) lần thứ 1 (cốc 1), thời gian từ 2 đến 3 h;

Ngâm trong Ethanol 90 % (thể tích) (3.1.2) lần thứ 2 (cốc 2), thời gian từ 2 đến 3 h;

Ngâm trong Ethanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1 (cốc 1), thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm trong Ethanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2 (cốc 2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

...

...

...

Ngâm trong xylen (3.1.3) lần thứ 2 (cốc 2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm tẩm parafin (3.1.6) lần thứ 1 (cốc 1), thời gian từ 2 h đến 3 h;

Ngâm tẩm parafin (3.1.6) lần thứ 2 (cốc 2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

Phụ lục C

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết DNA

Tách chiết DNA của Taenia spp. bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ dùng kít tách chiết DNAeasy ^® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504) như sau:

C.1  Pha dung dịch

...

...

...

- Dung dịch rửa 2: thêm 30 ml Ethanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào 13 ml dung dịch rửa AW2 đậm đặc.

C.2  Cách tiến hành

- Bước 1: ly giải mẫu

• Với mẫu nang nghi ngờ: nhỏ 180 ml dung dịch ATL vào ống 1,5 ml chứa phần dịch nổi sau khi được xử lý (6.3.3); nhỏ 20 µl protease K vào ống. Trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3), ủ qua đêm ở 56 °C đến khi kết thúc quá trình ly giải, và trộn lại bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3) 15 s trước khi chuyển sang bước 2;

- Bước 2: nhỏ 200 µl dung dịch AL vào ống; trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

- Bước 3: nhỏ 200 µl Ethanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3).

- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 µl dung dịch rửa 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 µl dung dịch rửa 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 3 min, loại bỏ ống thu;

...

...

...

- Bước 8: nhỏ 50 µl dung dịch AE vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 1 min

- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa DNA;

Bảo quản DNA ở nhiệt độ 2 °C - 8 °C nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc nhiệt độ -20 °C nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Trình tự cặp mồi, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phương pháp PCR - RFLP phát hiện bệnh gạo lợn, gạo bò ^[3]

D.1  Trình tự cặp mồi

Gen đích

...

...

...

Cặp mồi

Trình tự

Kích thước sản phẩm

12S

rDNA

Vòng 1

TaenF (mồi xuôi 1)

(5’GTTTGCCACCTCGATGTTGACT 3’)

846 bp

...

...

...

(5’CTCAATAATAATCGAGGGTGACGG 3')

Vòng 2

nTAE (mồi xuôi 2)

(5’ CGTGAGCCAGGTCGGTTCTTAT 3’)

766 bp

TnR (mồi ngược)

(5’CTCAATAATAATCGAGGGTGACGG 3’)

D.2  Thành phần phản ứng nhân gen bước 1, phản ứng Nested - PCR

TT

...

...

...

Thể tích
µl

1

Taq PCR Master Mix kít

12,5

2

Mồi xuôi (TaenF), 20 µM

0,5

3

Mồi ngược (TnR), 20 µM

...

...

...

3

Nước tinh khiết không có nuclease

6,5

Tổng thể tích

20

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng;

Cho 5 µl mẫu DNA có kích cỡ sản phẩm đã biết vào ống phản ứng: mẫu đối chứng dương;

Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng: mẫu đối chứng âm;

Cho 5 µl mẫu DNA kiểm tra vào ống phản ứng: mẫu kiểm tra;

...

...

...

D.3  Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen vòng 1, phản ứng Nested - PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

94 °C

4 min

1 vòng

94 °C

1 min

...

...

...

58 °C

1,5 min

72 °C

2 min

CHÚ Ý: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kit nhân gen. Khi sử dụng bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

D.4  Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen vòng 2, phản ứng Nested - PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

...

...

...

4 min

1 vòng

92 °C

45 s

25 vòng

57 °C

46 s

73 °C

1 min

...

...

...

D.5  Thành phần phản ứng PCR - RFLP^[3,7]

TT

Thành phần

Thể tích

1

Enzyme 1 (Ddel)

0,3

2

Enzyme 2 (Hinfl)

...

...

...

3

Enzyme 3 (Hpal)

0,6

4

Nước tinh khiết không có nuclease

6,3

5

Dung dịch đệm

1,5

...

...

...

9,0

Phụ lục E

(Quy định)

Dung dịch đệm TAE (dung dịch đệm axetat ethylenediamine tetra-acetic acid) hoặc TBE (dung dịch đệm borat ethylenediamine tetra-acetic acid)

E.1  Thành phần

Dung dịch TAE/TBE 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1 000 ml dung dịch TBE 1X

...

...

...

Lấy 100 ml dung dịch TBE 10X vào 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Phụ lục G

(Tham khảo)

Phương pháp Ag-ELISA phát hiện kháng nguyên vòng của Taenia spp.

G.1  Lấy mẫu

Lấy 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi (đối với bò) nghi mắc bệnh gạo.

Rút pittong để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng). Ghi ký hiệu mẫu, đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

...

...

...

G.2  Bảo quản mẫu

Mẫu xét nghiệm bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C), chuyển đến phòng thử nghiệm trong vòng 48 h. Trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ -20 °C.

G.3  Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng nguyên vòng của Taenia spp. ở lợn của hãng Apdia4)

G.3.1  Chuẩn bị

- Dung dịch rửa: pha loãng 50ml dung dịch rửa đậm đặc với 1 000 ml nước cất. Bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C;

- Hút 150 µl dung dịch TCA nhỏ vào ống eppendort chứa 150 µl mẫu đối chứng (âm, dương) và huyết thanh cần kiểm tra. Lắc và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-20 min. Tiếp tục lắc sau đó ly tâm với tốc độ 12 000 g trong từ 5 min đến 9 min;

- Nhỏ 150 µl dung dịch trong mỗi ống trên vào ống eppendort chứa 150 µl dung dịch Neutralision buffer.

G.3.2  Tiến hành phản ứng

...

...

...

- Nhỏ 100 µl đối chứng (âm, dương), mẫu kiểm tra đã chuẩn bị (xem 3.1, phụ lục G) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện trên 2 giếng;

- Phủ kín đĩa, ủ và lắc ở tủ ấm (4.3.1) trong 15 min với tốc độ 700 - 800 rpm;

- Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa;

- Nhỏ 100 µl dung dịch kháng kháng thể lợn vào từng giếng;

- Phủ kín đĩa, ủ và lắc ở tủ ấm (4.3.1) trong 15 min với tốc độ 700 - 800 rpm;

- Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa;

- Nhỏ 100 µl dung dịch cơ chất vào mỗi giếng;

- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 min;

- Nhỏ 50 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng;

...

...

...

G.3.3  Đọc kết quả

- Tính giá trị OD (mật độ quang học) của mẫu đối chứng (âm, dương) và huyết thanh cần kiểm tra.

- Tính giá trị ngưỡng (Cut-off) theo công thức sau:

Cut-off = OD_{đối chứng âm} x 3,5

- Chỉ số kháng nguyên (Ag Index):

Ag Index = OD_mẫuf/ cut-off

Giá trị mẫu đối chứng nằm trong khoảng giới hạn sau:

1) Ag Index của đối chứng dương: lớn hơn hoặc bằng 1,3

2) Ag Index của đối chứng âm: nhỏ hơn hoặc bằng 0,8

...

...

...

1) Ag Index nhỏ hơn hoặc bằng 0,8: mẫu âm tính

2) Ag Index lớn hơn hoặc bằng 1,3: mẫu dương tính

CHÚ Ý: kít phát hiện kháng thể Taenia spp. không thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng thể do tiêm vắc xin.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE, 2014. Mannual of diagnostic test and Vaccines for Terrestrial animals. Chapter 2.9.5. Cysticercosis.

[2] Boa ME, Kassuku AA, Iii ALW, Keyyu JD, Phiri IK, Nansen P., 2002. Distribution and density of cysticerci of Taenia solium by muscle groups and organs in naturally infected local finished pigs in Tanzania. 2002;106: p.155-64.

[3] Devleesschauwer B, Aryal A, Tharmalingam J, Joshi DD, Rijal S, Speybroeck N, et al., 2013. Complexities in using sentinel pigs to study Taenia solium transmission dynamics under field conditions. Vet Parasitol [Internet], Elsevier;193(1-3) : p.172-8.

[4] Geysen, D., Kanobana, K., Victor, B., Rodriguez-hidalgo, R., Borchgrave, J.D.E., Brandt, J.E.F., Dorny, P., 2007. Validation of Meat Inspection Results for Taenia saginata Cysticercosis by PCR - Restriction Fragment Length Polymorphism 70, p.236-240. doi:10.4315/0362-028X-70.1.236.

...

...

...

[6] Rodriguez-Hidalgo, R., Geysen, D., Benítez-Ortiz, W., Geerts, S., Brandt, J., 2002. Comparison of conventional techniques to differentiate between Taenia solium and Taenia saginata and an improved polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism assay using a mitochondrial 12 rDNA fragment. para J. Parasitol. 88, p. 1007-1011.

[7] WHO/FAO/OIE Guidelines for the surveillance, prevention and control of taeniosis/cysticercosis.

1) Sản phẩm do hãng Qiagen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

4) Sản phẩm do hãng Apdia cung cấp, mã sản phẩm REF 650 510. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-45:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò