Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch Tris - borate - EDTA (TBE) 10X

Thành phần

89mM Tris base (FW = 121)

108 g

89 mM Boric acid (FW = 61,8)

55 g

...

...

...

40 ml

Nước cất

1000 ml

Cách chuẩn bị

Hòa tan 89mM Tris base, c89 mM Boric acid và 0,5 M EDTA vào trong 1000 ml nước cất.

Phụ lục B

(Tham khảo)

...

...

...

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp.

Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

...

...

...

- Ly tâm lắng (5.2.5) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.4) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 μl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

...

...

...

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút Bluetongue

Bảng C.1 - Trình tự mồi và đoạn dò

Mồi và đoạn dò

Trình tự (5' - 3')

Mồi xuôi BTV

...

...

...

Mồi ngược BTV

ACA TCA TCA CGA AAC GCT TC

Đoạn dò BTV

FAM - ARG CTG CAT TCG CAT CGT ACG C- TAMRA

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

Thành phần nguyên liệu

(Theo hướng dẫn của kít Invitrogen Superscript III qRT-PCR Kit)

Nồng độ

μM

...

...

...

μl

Nước không có ARN và ADN

3,25

Dung dịch đệm 2X

12,5

Mồi xuôi BTV

20

...

...

...

Mồi ngược BTV

20

1,25

Đoạn dò BTV

6

1,25

Enzyme mix

0,5

...

...

...

5

Tổng thể tích cho 1 phản ứng

25

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR

Nhiệt độ

°C

Thời gian

...

...

...

50 (*)

15 phút (*)

01

95 (*)

2 phút (*)

01

95

15 giây

45

...

...

...

45 giây

(ghi nhận tín hiệu quang)

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít SuperScript ^® III Platinum ^® One step Quantitative RT-PCR System, Cat. No.: 11732-020 của hãng Invitrogen.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp RT- nested PCR phát hiện vi rút Bluetongue

D.1  Trình tự mồi

Bảng D.1 - Trình tự mồi xuôi và mồi ngược

...

...

...

Tên mồi

Trình tự (5’-3’)

1

Giai đoạn khuếch đại đầu tiên

Mồi xuôi BTV

GTT-CTC-TAG-TTG-GCA-ACC-ACC

Mồi ngược BTV

...

...

...

2

Giai đoạn khuếch đại lồng nhau

Mồi xuôi BTV 1

GCA-GCA-TTT-TGA-GAG-AGC-GA

Mồi ngược BTV 1

CCC-GAT-CAT-ACA-TTG-CTT-CCT

D.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

...

...

...

- Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít nhân gen PCR. Ví dụ sử dụng bộ kít One Step RT-PCR Kit Cat.No: 210210 3) (tham khảo bảng D.2).

- Tổng thể tích của phản ứng PCR là 25 μl (20 μl hỗn hợp Master mix và 5 μl mẫu ARN):

+ Cho 20 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 μl ARN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl ARN dương chuẩn của vi rút Bluetongue (mẫu ARN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút Bluetongue) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (hỗn hợp Master mix và mẫu ARN) vào máy PCR (5.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR (tham khảo bảng D.3).

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng RT-PCR cho giai đoạn khuếch đại đầu tiên

...

...

...

(Theo hướng dẫn của kít QIAGEN One Step RT-PCR Kit)

Nồng độ

μM

Thể tích cho 1 phản ứng

μl

Nước không có ARN và ADN

12,8

OneStep RT-PCR buffer 5X

...

...

...

5,0

dNTP Mix 10 nM

1,0

Mồi xuôi BTV

25

0,6

Mồi ngược BTV

25

...

...

...

Enzyme Mix

1,0

Mẫu chiết tách (ARN)

5,0

Tổng cộng

25

...

...

...

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

50 (*)

30 phút (*)

01

95 (*)

15 phút (*)

...

...

...

94

45 giây

35

58

45 giây

72

60 giây

72

7 phút

...

...

...

Giữ ở 4 °C

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít One Step RT-PCR Kit Cat.No: 210210 (Qiagen).

D.2.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho giai đoạn khuếch đại lồng nhau

- Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít nhân gen PCR. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq^®Master Mix, Catalogue Number: 203445 4) (tham khảo bảng D.4).

- Tổng thể tích của phản ứng PCR là 25 μl (24 μl hỗn hợp Master mix và 1 μl mẫu DNA giai đoạn khuếch đại đầu tiên):

+ Cho 24 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 1 μl mẫu DNA giai đoạn khuếch đại đầu tiên vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 24 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (hỗn hợp Master mix và mẫu ADN giai đoạn khuếch đại đầu tiên) vào máy PCR (5.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR (tham khảo bảng D.5).

Bảng D.4 - Thành phần phản ứng PCR cho giai đoạn khuếch đại lồng nhau

...

...

...

(Theo hướng dẫn của kít HotStarTaq DNA Polymerase)

Nồng độ

μM

Thể tích cho 1 phản ứng

μl

Nước không có ARN và ADN

9,5

Mồi xuôi BTV 1

...

...

...

1,0

Mồi ngược BTV 1

25

1,0

Dung dịch HotStarTaq Master Mix

12,5

Mẫu DNA giai đoạn khuếch đại đầu tiên

...

...

...

Tổng thể tích cho 1 phản ứng

25

Bảng D.5 - Chu trình nhiệt cho phản ứng giai đoạn khuếch đại lồng nhau

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

95 (*)

...

...

...

01

94

45 giây

28

62

45 giây

72

60 giây

72

...

...

...

01

Giữ ở nhiệt độ 4 °C đến khi chạy điện di

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít HotstarTag^® Master Mix, Cat. No.: 203445

D.2  Điện di sản phẩm PCR

- Chuẩn bị thạch Agarose (4.3.6) 2 % pha trong dung dịch TBE (4.3.6) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (4.3.7) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch dung dịch nạp mẫu (4.3.8)).

- Sử dụng thang chuẩn ADN 100 bp (4.3.9).

...

...

...

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

- Đọc kết quả:

+ Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương 101 bp.

+ Mẫu âm tính: Không có vạch.

- Đánh giá kết quả: có vi rút Bluetongue trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả RT-PCR dương tính. Nếu kết quả nghi ngờ cần lấy sản phẩm PCR giải trình tự gen.

Phụ lục E

(Tham khảo)

...

...

...

(Ví dụ: Sử dụng bộ kít ID Screen Bluetongue competition, mã sản phẩm BTC-5P của nhà sản xuất ID.VET - Pháp)

E.1  Chuẩn bị nguyên liệu

- Đưa tất cả các nguyên liệu trong bộ kít ổn định ở nhiệt độ phòng (21 °C ± 2 °C) và lắc đều để đồng nhất trước khi sử dụng

- Chuẩn bị dung dịch rửa 1X: Lắc dều dung dịch rửa nồng độ đậm đặc (20X) để chắc chắn dung dịch rửa đã hòa tan hoàn toàn và pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1/20 để được dung dịch rửa nồng độ 1X

E.2  Các bước thực hiện

- Cho 50 μl của Dilution Buffer 2 đến tất cả các giếng phản ứng.

- Cho 50 μl của Positive Control đến giếng A1 và B1.

- Cho 50 μl của Negative Control đến giếng C1 và D1.

- Cho 50 μl mẫu xét nghiệm vào các giếng còn lại.

...

...

...

- Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng Conjugate 10X theo tỷ lệ 1/10 trong Dilution Buffer 2.

Lưu ý, không rửa đĩa ở bước này.

- Cho thêm vào 100 μl Conjugate 1X đến tất cả các giếng.

- Ủ (30 ± 3) phút ở nhiệt độ (21 ± 5) °C.

- Rửa đĩa 300 μl/giếng, lặp lại 3 lần với nước rửa (Wash Solution).

- Cho 100 μl của Substrate (TMB) vào tất cả các giếng.

- Ủ (15 ± 2) phút ở nhiệt độ (21 ± 5) °C trong tối.

- Cho thêm 100 μl dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) đến tất cả các giếng phản ứng.

- Đọc đĩa và ghi nhận giá trị OD ở bước sóng 450 nm.

...

...

...

• Đánh giá kết quả

- Giá trị OD trung bình của đối chứng âm (OD Negative control_ OD_NC) lớn hơn 0,7.

OD_NC > 0,700.

- Tỷ lệ giá trị trung bình của đối chứng dương (OD Positive control_OD_PC) và Giá trị OD trung bình của đối chứng âm (OD Negative control_ OD_NC) phải nhỏ hơn 0,3.

OD_PC/OD_NC<0,3.

• Phân tích kết quả

Mỗi mẫu xét nghiệm, được tính theo phần trăm cạnh tranh (S/N %)

Phần trăm cạnh tranh (S/N %) = (OD _mẫu / OD _NC) x 100

• Giải thích kết quả

...

...

...

- Nếu mẫu lớn hơn hoặc bằng 40 % là mẫu âm tính.

- Nếu mẫu nhỏ hơn 40 % là mẫu dương tính.

Kết quả

Kết luận

S/N (%) ≥ 40 %

Âm tính

S/N (%) < 40 %

Dương tính

...

...

...

[1] OIE (Office International des Epizooties), 2014. Bluetongue (Infection with Bluetongue virus). Chapter 2.1.3. Terrestrial Manual.

[2] AAHL (Australian Animal Health Laboratory), 2014. Bluetongue Virus Real-time TaqMan Genotyping Assays. Molecular Diagnosis.

[3] ID.VET. Competitive ELISA for the detection of antibodies against the BTV VP7 protein in sheep, goat, cattle, buffalo or deer serum or plasma sample (BTC ver 0414 GB).

[4] Hofmann M., Griot C., Chaignat V., Perler L. and Thür B., 2008. Bluetongue disease reaches Switzerland. Schweiz. Arch. Tierheilk.,150: 49-56

1) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

4) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh