A.2.2  Cách chuẩn bị

Lắc đều cho tan, lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.4.6). Sử dụng tốt nhất trong 1 tuần, bảo quản ở âm 20 °C.

A.3  Dung dịch DPBS dùng cho duy trì và cấy chuyển tế bào

- Hòa tan 9,55 g bột DPBS (4.4.8) trong 1 lít nước cất 2 lần, hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min. sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

A.4  Môi trường nuôi tế bào (Sử dụng trong quá trình cấy chuyển và nuôi tế bào)

A.4.1  Thành phần

Môi trường DMEM

500 ml

Huyết thanh thai bê (FCS), 10 %

...

...

...

Kháng sinh (Penicillin/streptomycin: 10000 Ul/ml)

5 ml

Kháng nấm (Fungizone 250 µg/ml)

5 ml

A.4.2  Cách chuẩn bị

Bổ sung thành phần kháng sinh và kháng nấm vào môi trường DMEM, sau đó thêm huyết thanh thai bê 10 % theo đúng tỷ lệ. Bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

A.5  Chuẩn bị 1X TPCK (Tosylphenylalanychloromethane) trypsin: 1 mg/ml

A.5.1  Thành phần

...

...

...

10 ml

PBS (xem A.1)

900 ml

A.5.2  Cách chuẩn bị

Lắc đều TPCK trypsin trong PBS, sau đó lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.12), sau đó chia nhỏ lượng ra ống và bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Sử dụng tốt nhất trong 6 tháng.

A.6  Cấy chuyển và nuôi tế bào

A.6.1  Nguyên vật liệu:

Chai nuôi tế bào 25 cm² đã phát triển thành 1 lớp đạt 90 % bề mặt chai

...

...

...

Trypsin có 0,05 % EDTA

PBS ~ pH 7,4 (xem A.1, phụ lục A)

Chú ý: tất cả các môi trường phải được cân bằng ở 37 °C và các vật tư dùng cho nuôi cấy tế bào đều phải đảm bào vô trùng trước khi sử dụng.

A.6.2  Cách tiến hành

- Hút bỏ môi trường trong chai tế bào 25 cm² đang nuôi tế bào CV1/SLAM 1 lớp 80 % bề mặt chai.

- Rửa bề mặt thảm tế bào bằng 5 ml DPBS 1X, tráng qua và hút bỏ DPBS.

-Thêm 5 ml trypsin 1X EDTA vào chai tế bào 25 cm² láng đều lên bề mặt tế bào sao cho bề mặt tế bảo được phủ trypsin. Ủ trong thời gian từ 5 min đến 10 min trong tủ ấm ở 37 °C (5.8).

Chú ý: Không để tế bào trong trypsin quá 15 min.

Khi tế bào đã tách hết, bổ sung 5 ml DMEM có 10 % FBS vào chai để vô hoạt trypsin, trộn đều, chuyển toàn bộ huyễn dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml.

...

...

...

- Hoàn nguyên cặn với 10 ml DMEM bổ sung 10 % FBS, chuyển vào chai nuôi cấy 25 cm²

Nuôi chai tế bào trong tủ ấm 37 °C có 5 % CO₂.

Theo dõi sự phát triển hàng ngày của tế bào trên kính hiển vi soi ngược. Sau 3 ngày lại thay môi trường nuôi cấy. Đến khi tế bào phát triển thành một lớp bao phủ 90 % dĩa nuôi cấy thì lại tiến thành cấy chuyển lặp lại như quy trình trên đây.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết RNA

CẢNH BÁO: Việc tách chiết RNA có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Nếu sử dụng kít chiết tách Qiagen RNeasy minikit1 (4.2.1), thì các bước chiết tách được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

...

...

...

B.2  Tiến hành chiết tách

- Cho 200 µl huyễn dịch đã xử lý (7.3.1.1) vào ống eppendorf loại 1,5 ml, thêm 600 µl RLT (xem B.1), lắc đều trên máy lắc trộn (5.1.4 ) rồi ly tâm nhẹ (5.1.7).

- Thêm 500 µl etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn, ly tâm nhẹ.

- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc ≥ 8.000 g ở nhiệt độ phòng.

- Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vảo cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8.000 g, thay ống thu mới vào cột lọc.

- Cho 500 µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8.000 g, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở gia tốc tối đa, bỏ ống thu.

- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 µI nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm cột lọc trong 1 min ở gia tốc ≥ 8000 g, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi làm phản ứng, nếu sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở âm 20 °C hoặc nhiệt độ thấp hơn.

...

...

...

(Tham khảo)

Trình tự cặp mồi, mẫu dò, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút dịch tả loài nhai lại nhỏ

Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi, mẫu dò phát hiện vi rút dịch tả loài nhai lại nhỏ

Mẫu dò, mồi

Kí hiệu

Trình tự (5’-3’)

Mẫu dò

PPR-P

FAM-CGGCTGAGGCACTCTTCAGGCTGC-BHQ1

...

...

...

PPR-F

GAGTCTAGTCAAAACCCTCGTGAG

Mồi ngược

PPR-R

TCTCCCTCCTCCTGGTCCTC

GHI CHÚ:

Trình tự cặp mồi và mẫu dò trong Bảng C.1 được được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) khuyến cáo sử dụng. Các phòng thí nghiệm có thể sử dụng cặp mồi và mẫu do khác theo khuyến cáo của phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE hoặc khi OIE cập nhật trình tự cặp mồi và mẫu dò mới.

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

Sử dụng Quantabio-qScript™XLM One-step RT-qPCR Tough Mix® (Hãng Quantabio; Cat no: 95132-500)

...

...

...

Thể tích (µl)

Nước tinh khiết không có nuclease

6,0

2X Reaction buffer

12,5

Mồi xuôi (20µM)

0,5

Mồi ngược (20µM)

0,5

...

...

...

0,5

Mẫu RNA

5,0

Tổng thể tích

25

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime RT-PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

...

...

...

10 min

1 chu kỳ

95 °C

2 min

95 °C

15 s

40 chu kỳ

60 °C

45 s

...

...

...

(Quy định)

Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng cách sử dụng Haemocytometer

D.1  Các bước thực hiện.

- Làm sạch buồng đếm và nắp kính.

- Nhẹ nhàng khuấy chai nuôi tế bào để trộn đều đồng nhất.

- Hút 200 ul dung dịch tế bào vào ống eppendorf mới, bổ sung 200 ul trypan blue 0.4 %, trộn đều.

- Hút 100 ul dung dịch tế bào và trypan blue vào buồng đếm, nhỏ dung dịch vào cạnh buồng đếm dung dịch sẽ theo mao dẫn đi vào đầy các ngăn.

- Đếm các tế bào còn sống (là các tế bào không bị nhuộm màu trypan blue) tại 4 hình vuông ở 4 góc.

D.2  Tính toán kết quả

...

...

...

Trong đó:

Ct: số lượng tế bào ban đầu có trong 1 ml

T: tổng số tế bào tại 4 góc vuông

Tb: hệ số pha loãng giữa dung dịch tế bào với trypan blue

1/4: hệ số góc vuông

10⁴: hệ số chuyển đổi

Ví dụ: Đếm tổng số tế bào tại 4 góc vuông có 480 tế bào, Ct = 480 x 2 x ¼ x 10⁴ = 240.10⁴ =2.4.10⁶ tb/ml.

Phụ lục E

(Quy định)

...

...

...

Công thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí nghiệm (TCID₅₀) của Reed-Muench:

TCID₅₀ = 10^x

Với x được tính như sau:

Trong đó:

A

là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút sát trên 50 %, tính bằng phần trăm (%).

B

là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút sát dưới 50 %, tính bằng phần trăm (%).

a

...

...

...

b

là nồng độ pha loãng vi rút tại B (lấy giá trị số mũ).

VÍ DỤ:

Nồng độ vi rút pha loãng

Tỷ lệ giếng nhiễm vi rút^(a)

Phản ứng

Giá trị cộng dồn

Tỷ lệ giếng nhiễm vi rút, %

Nhiễm

...

...

...

Nhiễm

Không nhiễm

Tỷ số

10^-6

5/5

5

0

11

0

...

...

...

100

10^-7

4/5

4

1

6

1

6/7

86

...

...

...

2/5

2

3

2

4

2/6

33

10^-9

0/5

...

...

...

5

0

9

0/9

0

CHÚ THÍCH: (a) số giếng nhiễm vi rút/số giếng gây nhiễm với lượng nhiễm là 100 µl/giếng. Mũi tên chỉ hướng tăng lên của số nhiễm và số không nhiễm.

Trong 100 µl dung dịch pha loãng vi rút nhiễm vào mỗi giếng có:

Vậy TCID₅₀ là: 10^7,68/ 100 µl dung dịch pha loãng vi rút.

...

...

...

(Tham khảo)

Quy trình thực hiện phản ứng ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả loài nhai lại nhỏ

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể PRRV có bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.Có thể sử dụng ID Screen PPR Competition kit - Code 4P2

F.1  Chuẩn bị nguyên liệu

- Nguyên liệu trong bộ kít (4.3.1) để ở nhiệt độ phòng 30 min trước khi làm phản ứng.

- Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml dung dịch nước rửa đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (4.3.2). Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 µl/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng. Thiết lập sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có đối chứng âm (Negative Control - NC), đối chứng dương (Positive Control - PC)

F.2  Cách tiến hành

1 Nhỏ 25 µl Dilution Buffer 13 vào các giếng;

Nhỏ 25 µl Positive Control vào hai giếng A1 và B1

...

...

...

Nhỏ 25 µl huyết thanh cần kiểm tra (7.4.1) vào các giếng còn lại.

2. Ủ dĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 37 °C ± 3 °C trong 45 min

3. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; rửa đĩa bằng cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần, tránh làm khô đĩa giữa các lần rửa.

4. Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng Conjuate 10X 1/10 với Dilution Buffer 4

5. Nhỏ 100 µl dung dịch Conjugate 1X vào các giếng;

6. Ủ đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C trong 30 min ± 3 min

7. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; rửa đĩa bằng cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Rửa lặp lại 3 lần, tránh làm khô đĩa giữa các lần rửa

8. Nhỏ 100 µl dung dịch Subtrate Solution vào các giếng;

9. Ủ đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C trong 15 min ± 2 min trong phòng tối

...

...

...

11. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (5.3.1) ở bước sóng 450 nm

F.3  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mật độ quang học (OD) của đối chứng âm (ODNC) > 0,7.

- Mật độ quang học của đối chứng dương (ODPC)/OD của đối chứng âm (ODNC) <0,3.

Đánh giá kết quả

+ Mẫu dương tính khi: S/N% ≤ 50%.

+ Mẫu âm tính khi: S/N % > 60%

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Adombi, C. M., Lelenta, M., Lamien, C. E., Shamaki, D., Koffi, Y. M., Traore, A., & Luckins, A. G. (2011). Monkey CV1 cell line expressing the sheep-goat SLAM protein: a highly sensitive cell line for the isolation of peste des petits ruminants virus from pathological specimens. Journal of Virological Methods, 173(2), 306-313.

[2] Aktas et al, 2011. Peste des petits ruminants in suckling lambs case report Israel journal of veterinary medicine, Vol 66(1).

[3] Ammerman Nicole et al, 2008. Growth and Maintenance of Vero Cell Lines. Curr Protoc Microbiol.

[4] Naveen Kumar et al, 2014. Peste Des Petits Ruminants Virus Infection of Small Ruminants: A Comprehensive Review. Viruses 2014, 6, 2287-2327.

[5] OIE, 2013. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Chapter 2.7.10: Peste des petits ruminants (Infection with peste des petits ruminants virus).

[6] Olivier Kwiateka et al, 2010. Quantitative one-step real-time RT-PCR for the fast detection of the four genotypes of PPRV. Journal of Virological Methods 165, 168-177.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-42:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 42: Bệnh dịch tả loại nhai lại nhỏ