Natri clorua (NaCl) |
8,0 g |
Kali clorua (KCl) |
0,2 g |
Natri hydrophosphat (Na2HPO4) |
1,15 g |
Kali dihydrophosphat (KH2PO4) |
0,2 g |
Nước cất |
1000 ml |
Cách chuẩn bị
Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.
GHi CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.2 Dung dịch đệm glycerin pH ~ 8,3
Thành phần:
Natri dihydrocacbonat (NaHCO3)
0,0715 g
Dinatri cacbonat (Na2CO3)
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước cất vô trùng
10 ml
Glycerin vừa đủ
100 ml
Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, dùng khi đọc huỳnh quang.
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:
B.1 Chuẩn bị
- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.
- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.
B.2 Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF
- Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.
- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.
- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.
- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.
- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.
- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 pl dung dịch hạt từ.
- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.
- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.
Phương pháp PCR phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu Phi
C.1 Trình tự mồi
Bảng C.1 - Trình tự mồi xuôi và mồi ngược
Mồi
Chuỗi (5’ -3’)
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi xuôi: PPA-1
AGT-TAT-GGG-AAACCC-GAC-CC
257
Mồi ngược: PPA-2
CCC-TGA-ATC-GGA-GCATCC-T
Bảng C.2 - Thành phần phản ứng PCR
Thành phần nguyên liệu
(Theo hướng dẫn của kít Hot start Taq Gold DNA polymerase)
Nồng độ
μM
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước không có DNAse và RNAse
17,375
Dung dịch đệm HotStar 10X
2,5
MgCI2 25 nM
2
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5
Mồi xuôi
20
0,25
Mồi ngược
20
0,25
Taq Gold DNA polymerase 5U
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,125
Mẫu chiết tách ADN
2
Tổng thể tích cho 1 phản ứng
25
Bảng C.3 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Bước
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thời gian
Nhiệt độ
°C
1
1
10 phút
95
2
40
15 giây
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
30 giây
62
30 giây
72
3
1
7 phút
72
Giữ ở nhiệt độ 4 °C đến khi chạy điện di
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Chuẩn bị thạch Agarose (4.2.6) 2 % pha trong dung dịch TBE (4.2.7) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (4.2.8) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).
- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.
- Cho mẫu vào các giếng (10 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch dung dịch nạp mẫu (loading dye)).
- Sử dụng thang chuẩn ADN (100 bp) (4.2.9).
LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.
- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V- 100 V.
- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.
- Đọc kết quả:
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+ Mẫu âm tính: Không có vạch.
- Đánh giá kết quả: có vi rút dịch tả lợn Châu Phi trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả PCR dương tính. Nếu kết quả nghi ngờ cần lấy sản phẩm PCR giải trình tự gen.
Phương pháp realtime PCR phát hiện vi rút Dịch tả lợn Châu Phi
Bảng D.1 -Trình tự mồi và đoạn dò
STT
Mồi và đoạn dò
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
Mồi xuôi ASFV
CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA
2
Mồi ngược ASFV
GATACCACAAGATCRGCCGT
3
Đoạn dò ASFV
FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
STT
Thành phần
nguyên liệu
(Theo
hướng dẫn của kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG)
Nồng độ
μM
Thể tích
cho 1 phản ứng
μl
1
Nước không có RNAse và DNAse
5,5
2
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
20
0,5
3
Mồi ngược ASFV
20
0,5
4
Đoạn dò ASFV
6 μM
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5
Dung dịch SuperMix
12,5
6
Mẫu chiết tách (ADN)
5
Tổng thể tích cho 1 phản ứng
25
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nhiệt độ
°C
Thời gian
Số chu kỳ
50 (*)
2 phút (*)
01
95 (*)
2 phút (*)
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
95
15 giây
45
60
45 giây
(ghi nhận tín hiệu quang)
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017.
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể ASFV
Sử dụng kít thương mại Ingezim PPA compac 11.PPA.K3
E.1 Chuẩn bị nguyên liệu
- Tất cả các nguyên liệu (ngoại trừ Conjugate) để 30 phút ở nhiệt độ phòng (20 °C đến 25 °C) trước khi tiến hành phản ứng.
- Pha loãng dung dịch nước rửa 40 X: 40 ml dung dịch nước rửa đậm đặc với 960 ml nước khử ion.
E.2 Cách tiến hành
1. Nhỏ 50 μl Dilution Buffer vào các giếng:
Nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng dương vào 2 giếng (ví dụ: A1 và B1)
Nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng âm vào 2 giếng (ví dụ: A2 và B2)
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2. Dán đĩa lại và ủ ở nhiệt độ 36 °C (± 1 °C) trong 1 giờ ± 5 phút hoặc qua đêm (từ 16 giờ đến 20 giờ) ở nhiệt độ phòng từ 20 °C đến 25 °C.
3. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa vào bình chất thải chứa dung dịch NaOH; rửa đĩa bằng cách thêm 300 μl dung dịch nước rửa đã pha ở 1 vào các giếng, rồi đổ bỏ. Lặp lại 4 lần.
4. Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng conjugate 100 X (ví dụ: 110 μl conjugate vào 11 ml Dilution), lắc nhẹ trước khi dùng.
5. Nhỏ 100 μl dung dịch Conjugate 1 X vào tất cả các giếng.
6. Dán đĩa và ủ ở nhiệt độ 36 °C (± 1 °C) trong 30 phút.
7. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa như bước 3.
8. Nhỏ 100 μl dung dịch Subtrate vào các giếng. Đặt đĩa ở nhiệt độ phòng từ 20 °C đến 25 °C trong vòng 15 phút.
9. Thêm 100 μl dung dịch stop Solution vào các giếng để dừng phản ứng.
10. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (mục 5.3.1) ở bước sóng 450 nm trong vòng 5 phút sau khi dừng phản ứng.
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Điều kiện phản ứng được công nhận khi: NC/PC ≥ 4, trong đó:
NC: Mật độ quang học (OD) trung bình của đối chứng âm
PC: Mật độ quang học (OD) trung bình của đối chứng dương
- Đánh giá kết quả dựa trên X % của mẫu theo công thức sau:
X% = [(NC - Sample OD)/ (NC-PC)] x 100 %
+ Mẫu dương tính khi: X % ≥ 50 %
+ Mau âm tính khi: X % ≤ 40 %
+ Mẫu có giá trị 40 % < X % < 50 % được cho là nghi ngờ
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[1] OIE (Office International des Epizooties), 2012. African swine fever. Chapter 2.8.1. Terrestrial Manual.
[2] AAHL (Australian Animal Health Laboratory) Regional Programme, 2011. African Swine Fever TaqMan Assay. Nucleic Acid Detection for Disease Diagnosis and Emergency Disease Investigation.
[3] Chi Cục Thú Y Vùng VI, 2017. Quy trình phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu Phi bằng kỹ thuật realtime PCR.
1) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.
2) và 3) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-41:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi
Số hiệu: | TCVN8400-41:2019 |
---|---|
Loại văn bản: | Tiêu chuẩn Việt Nam |
Nơi ban hành: | *** |
Người ký: | *** |
Ngày ban hành: | 01/01/2019 |
Ngày hiệu lực: | Đã biết |
Tình trạng: | Đã biết |
Văn bản đang xem
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-41:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi
Chưa có Video