- Công thức áp dụng cho kit RT-PCR của hãng Invitrogen:

Thành phần

Lượng (ml)

H₂O

5,5

2X hỗn hợp phản ứng

12,5

Hỗn hợp enzym

0,5

...

...

...

0,5

Mồi ngược

0,5

Probe

0,5

Mẫu RNA

5

Tổng cộng

25

...

...

...

Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR bằng phần mềm trên máy vi tính.

Qiagen one-step RT-PCR Kit

Invitrogen superscript 3 qRT-PCR Kit

RT

PCR

RT

PCR

50 °C-30 min

95 °C-15 min

...

...

...

50 °C-15 min

95 °C-2 min

40 x (95 °C-10 s + 58 °C-50 s)

Trình tự chuỗi mồi và probe dùng trong phản ứng rRT-PCR

Gen mục tiêu

Tên PPP

Mồi/ Probe

Trình tự (5’ - 3’)

Điều chỉnh

...

...

...

3’

Avian paramyxovirus type 1 (Matrix)

APMV

Probe

TTCTCTAGCAGTGGGACAGCCTGC

FAM

BHQ1

Xuôi

AGTGTAGTGCTCGGACCTTC

...

...

...

None

Ngược

CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA

None

None

Newcastle disease virus (vero+meso) (Fusion)

NDV-1

Probe

AAGCGTTTCTGTCTCCTCCTCCA

...

...

...

BHQ1

Xuôi

GGTGAGTCTATCCGGARGATACAAG

None

None

Ngược

AGCTGTTGCAACCCCAAG

None

None

...

...

...

NDV-2

Probe

CCGGCATTCTGGTTTCACTCAA

FAM

BHQ1

Xuôi

CGTTCTGAGGAATTTGACAGYMT

None

None

...

...

...

GRAGCCATGCGAAYTTGG

None

None

A.3. Đánh giá kết quả xét nghiệm

- Mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị C_t (ngưỡng vòng) như đã biết (± 2 Ct) và mẫu đối chứng âm tính phải có C_t = 0 thì kết quả rRT-PCR mới được công nhận.

- Mẫu có giá trị C_t £ 35 được coi là dương tính.

- Mẫu không có Ct được coi là âm tính.

- Mẫu có giá trị C_t trong khoảng từ 35 đến 40 được coi là nghi ngờ. Những mẫu nghi ngờ này cần được xác chẩn bằng phương pháp phân lập virus trước khi có kết luận chẩn đoán cuối cùng.

...

...

...

(Quy định)

Chuẩn bị huyễn dịch hồng cầu gà 1 %

Gà lấy máu là gà trống đã trưởng thành, khỏe mạnh, âm tính kháng thể Niu cát xơn. Nuôi gà ở chuồng an toàn dịch bệnh, dùng để lấy máu thường xuyên.

Sát trùng vị trí lấy máu (tĩnh mạch cánh hoặc tim) bằng bông cồn 70 %.

Dùng bơm tiêm từ 5 ml đến 10 ml hút khoảng 1ml dung dịch chống đông (Natri xitrat 4 %            hoặc Alserver...) hút lấy máu gà. Cho máu vào ống nghiệm.

Rửa hồng cầu: Cho nước sinh lý (hoặc PBS) vào ống lấy máu, một lượng gấp đôi lượng máu trong ống, lắc đều. Ly tâm ở 1000 xg trong 10 min, bỏ huyết tương ở trên. Rửa như trên từ 2 lần đến 3 lần. Sau lần ly tâm cuối, bỏ nước ở trên, lấy hồng cầu để pha. Hoặc có thể sử dụng máy ly tâm Hematocrit để ly tâm sẽ được hồng cầu đặc có lượng chính xác khi pha.

Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1 %. Ví dụ: 1ml hồng cầu đặc và 99 ml nước sinh lý.

Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong một tuần (nếu huyễn dịch hồng cầu bị dung huyết phải loại bỏ). Hồng cầu không dùng hết, cần cho nước sinh lý (hoặc PBS, Alserver) vào bảo quản. Khi cần, ly tâm lại để dùng.

...

...

...

(Quy định)

Phương pháp tiêm truyền bệnh phẩm vào trứng gà có phôi

C.1. Xử lý bệnh phẩm

Não hoặc các phủ tạng được nghiền trong cối chày sứ vô trùng, pha thành huyễn dịch 1 : 10 với nước sinh lý (hoặc PBS pH từ 7,0 đến 7,4) có kháng sinh (Penicillin 200 Ul/ml, Streptomycin 2 mg/ml). Để ở tủ lạnh 4 °C trong 2 h. Ly tâm ở 1000 xg trong 15 min, lấy nước trong ở trên để tiêm phôi trứng.

C.2. Tiêm trứng gà có phôi

- Dùng trứng gà có phôi từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi, lấy từ trại gà sạch bệnh;

- Soi trứng, chọn phôi khỏe. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm từ 3 phôi đến 5 phôi;

- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70 %. Dùi vị trí tiêm ở phía trên buồng hơi;

- Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm rồi tiêm 0,2 ml vào xoang niệu mô;

...

...

...

- Ủ ấm trong tủ ấm từ 37 °C đến 38 °C. Ngày soi trứng 2 lần, loại bỏ phôi chết trước 24 h. Theo dõi từ 5 ngày đến 7 ngày;

- Các trứng có phôi chết hoặc gần chết để vào tủ lạnh 4 °C. Phôi nhiễm virus Niu cát xơn cường độc thường chết từ 24 h đến 60 h;

- Sau 5 ngày đến 7 ngày các trứng không chết được để tủ lạnh 4 °C giết phôi.

C.3. Thu hoạch nước trứng

- Mổ trứng trong điều kiện vô trùng. Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70 %;

- Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô;

- Hút nước trứng vào ống Eppendorf vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 4 °C để kiểm tra;

- Kiểm tra bệnh tích: phôi có xuất huyết lấm tấm ở da đầu, thân, chân, cánh;

Nước trứng sau khi thu hoạch được làm phản ứng ngưng kết hồng cầu-HA nhằm xác định sự nhân lên của virus trong phôi.

...

...

...

Phụ lục D

(Quy định)

Kỹ thuật làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà

D.1. Nguyên liệu

- Hồng cầu gà 1 % (Phụ lục B).

- Nước trứng thu hoạch (hoặc kháng nguyên chuẩn Niu cát xơn).

- Dung dịch PBS pH từ 7,0 đến 7,4.

D.2. Tiến hành phản ứng

Dùng đĩa ngưng kết 96 giếng, đáy chữ V hoặc chữ U. Bổ sung 25 ml PBS từ giếng 1 đến giếng 12. Thêm 25 ml kháng nguyên (nước trứng thu hoạch hoặc kháng nguyên chuẩn) vào giếng 1;

...

...

...

Nhỏ thêm 25 ml PBS vào tất cả các giếng.

Thêm hồng cầu: Mỗi giếng 25 ml, lắc nhẹ 1 min. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Sau 15 min đến 25 min đọc kết quả (không đọc muộn hơn 25 min).

D.3. Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm.

- Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn.

Hiệu giá ngưng kết HA được tính ở độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn xuất hiện ngưng kết hoàn toàn. Ví dụ: giếng cuối cùng còn có ngưng kết hoàn toàn, hiệu giá HA = 1/256 (hay 8 log₂).

Nguyên liệu

Giếng

1

...

...

...

3

4

5

6

7

8

9

10

11

...

...

...

đối chứng

PBS (ml)

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

25

25

25

Kháng nguyên (ml)

25

Trộn đều, chuyển 25 từ giếng 1 đến 11 rồi hút bỏ 25 ml

0

PBS

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

25

Hồng cầu (ml)

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

25

25

25

25

Độ pha loãng KN

...

...

...

D.4. Nhận định kết quả

...

...

...

- Nếu phản ứng HA âm tính: Có thể trong bệnh phẩm không có mặt virus Niu cát xơn hoặc lượng virus quá ít. Vì vậy, cần tiêm phôi trứng 1 lần nữa (dùng nước trứng thu hoạch lần 1 để tiêm truyền)

Phụ lục E

(Quy định)

Kỹ thuật làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà

E.1. Nguyên liệu

- Dung dịch PBS pH từ 7,0 đến 7,4.

- Hồng cầu gà 1 %.

- Huyết thanh kiểm tra (hoặc kháng huyết thanh chuẩn Niu cát xơn).

...

...

...

- Kháng nguyên dùng cho phản ứng HI được pha 4 HAU.

E.2. Cách pha và chuẩn độ kháng nguyên 4 HAU

Ví dụ: Hiệu giá kháng nguyên trong phản ứng HA là 1/256 thì 4 HAU bằng 1/256 x 4 = 1/64.

Pha 4 HAU gồm 1 phần kháng nguyên và 63 phần PBS.

Chuẩn độ kháng nguyên 4 HAU đã pha bằng phản ứng HA. Nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc. Nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên là kháng nguyên pha loãng. Dựa vào kết quả đó để bổ sung thêm kháng nguyên hoặc PBS để có kháng nguyên 4 HAU chuẩn.

E.3. Trình tự tiến hành phản ứng

Nguyên liệu

Giếng

1

...

...

...

3

4

5

6

7

8

9

10

11

...

...

...

đối chứng

PBS (ml)

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

25

25

50

Huyết thanh

25

Trộn đều, chuyển 25 từ giếng 1 đến 11 rồi hút bỏ 25 ml

0

KN 4 HA (ml)

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

25

25

...

...

...

0

Lắc đều, để 30 min ở nhiệt độ phòng

Hồng cầu (ml)

25

25

25

25

25

25

...

...

...

25

25

25

25

25

Độ pha loãng HT

...

...

...

E.3.1. Cách tiến hành

...

...

...

Cho PBS vào mỗi giếng 25 ml từ giếng 1 đến giếng 12;

Cho 25 ml huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1;

Pha loãng huyết thanh: Trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 1, rồi hút 25 ml chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 ml chuyển sang giếng 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút bỏ 25 ml đi ở giếng 11;

Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ số 1 đến số 11, mỗi giếng 25 ml. Giếng 12 cho thêm 25 ml PBS;

Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng;

Cho hồng cầu: Mỗi giếng 25 ml, lắc nhẹ 1 min. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Sau 15 min đến 25 min đọc kết quả (không đọc muộn hơn 25 min).

E.3.2. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng.

Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.

...

...

...

E.4. Đánh giá kết quả

Mẫu là huyết thanh kiểm tra kháng thể: Các con gà chưa được chủng vắc xin có kháng thể lớn hơn hoặc bằng 1/16 (4 log₂) thì mẫu đó được coi là nhiễm virus Niu cát xơn.

Mẫu là kháng nguyên (nước trứng giám định virus phân lập):

- Nếu có hiện tượng ức chế ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn Niu cát xơn chứng tỏ virus phân lập là virus Niu cát xơn.

- Nếu không có hiện tượng ức chế ngưng kết, mà phôi chết, có bệnh tích xuất huyết đồng thời HA dương tính thì trong bệnh phẩm có virus (cũng gây ngưng kết hồng cầu) nhưng không phải Niu cát xơn. Có thể làm phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một số virus khác (Cúm, EDS...) để xác định nguyên nhân bệnh.

Phụ lục F

(Quy định)

Phương pháp xác định chỉ số độc lực trên não gà con

...

...

...

Gà được theo dõi trong 8 ngày liền, ghi lại những biểu hiện sức khỏe.

Biểu hiện bệnh được tính bằng điểm:

- Bình thường: 0 điểm

- Ốm: 1 điểm

- Chết: 2 điểm (các ngày còn lại sau khi chết được chấm 2 điểm)

Ví dụ thí nghiệm có kết quả theo dõi như trong bảng dưới đây:

Gà số

Ngày sau công virus Niu cát xơn

Tổng số điểm

...

...

...

1

2

3

4

5

6

7

8

1

...

...

...

1

2

2

2

2

2

2

13

1,625

...

...

...

1

1

2

2

2

2

2

2

14

...

...

...

3

0

0

2

2

2

2

2

2

...

...

...

1,5

4

0

2

2

2

2

2

2

...

...

...

14

1,75

5

2

2

2

2

2

2

...

...

...

2

16

2

6

2

2

2

2

2

...

...

...

2

2

16

2

7

2

2

2

2

...

...

...

2

2

2

16

2

8

1

2

2

...

...

...

2

2

2

2

15

1,875

9

0

2

...

...

...

2

2

2

2

2

14

1,75

10

1

...

...

...

2

2

2

2

2

2

15

1,875

Tổng hợp

...

...

...

1,813

Chỉ số ICPI đối với mỗi gà thí nghiệm là số điểm trung bình của gà đó sau 8 ngày theo dõi. Điểm trung bình của cả lô thí nghiệm (10 gà) là chỉ số ICPI của virus Niu cát xơn được dùng. Theo OIE, nhóm Lentogenic có ICPI xấp xỉ 0. Nếu chỉ số ICPI ³ 0,7 thì virus Niu cát xơn phân lập được coi là có độc lực gây ra ổ dịch. Các nhóm virus có độc lực càng cao sẽ có chỉ số ICPI càng gần giá trị 2,0.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn - Cục Thú y, 2006. Tiêu chuẩn, quy trình ngành thú y, Quy trình chẩn đoán bệnh Newcatsle/10 TCN 719-2006, trang 221-234.

[2] O.I.E., 2009. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Newcastle disease, chapter 2.3.14.

[3] Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn - Viện Thú y quốc gia 2002. (2002). Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam, in lần thứ nhất, Bệnh New cát xơn, trang 172-173.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-4:2010 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 1: Bệnh Niu Cát Xơn