6.1.4.3  Tiến hành phản ứng realtime RT- PCR

Ví dụ: sử dụng phương pháp realtime RT- PCR với cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2) và kit Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR kit cat # 11732-020 (3.2.2).

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml, và có đầy đủ đối chứng âm và đối chứng dương trong mỗi lần chạy phản ứng realtime PCR.

+ Thành phần cho một phản ứng realtime PCR (theo hướng dẫn của kít thương mại) Bảng 2.

+ Đối chứng dương: Là mẫu ARN được tách chiết từ mẫu virus RED chuẩn.

+ Đối chứng âm: sử dụng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.5).

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

- Chuyển 20 ml hỗn hợp thành phần phản ứng realtime PCR (Bảng 2) vào ống phản ứng (ống PCR 0,2 ml)

- Cho 5 ml mẫu ARN vào ống phản ứng.

...

...

...

Bảng 2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

Thành phần

Thể tích, ml

Nước tinh khiết không có nuclease

4,5

Dung dịch nhân gen 2x

12,5

Magie clorua (MgCl₂), 50 mM

1,0

...

...

...

1,5

Enzym

0,5

Tổng thể tích

20

Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit sử dụng cho phản ứng. Đối với kít kit Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR kit cat # 11732-020, chu kỳ nhiệt được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime RT - PCR

Nhiệt độ

Thời gian

...

...

...

50 °C

15 min

1 vòng

95 °C

2 min

95 °C

10 s

40 vòng

60 °C

...

...

...

CHÚ THÍCH: - Phản ứng realtime RT - PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm. Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.1.4.4  Đọc kết quả

Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị C_t ≤ 35 (± 2 C_t), mẫu đối chứng âm không có C_t.

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị chu kỳ ngưỡng C_t ≤ 35 được coi là dương tính,

2) Mẫu không có giá trị chu kỳ ngưỡng C_t = 0 là âm tính.

3) Mẫu có giá trị chu kỳ ngưỡng C_t ≤ 40 và >35 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 đề khẳng định và kết luận cuối cùng.

6.2  Phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA

...

...

...

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22 G vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở vịnh tĩnh mạch cổ lợn nghi mắc bệnh PED. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.2.2  Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản theo mục 6.1.2.

6.2.3  Chuẩn bị mẫu

Tất cả các mẫu máu được chắt huyết thanh từ xylanh (6.2.1) sang ống nghiệm vô trùng khác. Thời gian kể từ lúc lấy máu cho đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.2.4  Cách tiến hành

Hiện nay, có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể PED bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất^[2].

CHÚ THÍCH: Phương pháp này nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, không phân biệt được kháng thể do tiêm phòng vắc xin PED hay kháng thể do nhiễm thực địa.

Ví dụ: sử dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PED theo quy trình của kit PED Ab hãng IDEXX thì các bước tiến hành được thực hiện như sau:

...

...

...

- Nguyên liệu của bộ kít (3.4.1) để ở nhiệt độ phòng từ 20 đến 30 phút trước khi làm phản ứng.

- Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml dung dịch nước rửa đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (3.4.2).

- Pha loãng mẫu với tỷ lệ 1/40: 10 ml mẫu kiểm tra với 390 ml dung dịch pha loãng mẫu trong ống pha loãng. Sau đó 100 ml dung dịch mẫu kiểm tra đã pha loãng sang đĩa ELISA với bố trí mẫu tương ứng.

b) Các bước tiến hành

Bố trí sơ đồ đĩa ELISA phản ứng (tham khảo Phụ lục C).

- Chuẩn bị bộ kit: Xác định số mẫu kiểm tra, 01 đối chứng dương, 01 đối chứng âm;

- Nhỏ 100 ml đối chứng âm và đối chứng dương (không pha loãng) vào đĩa ELISA theo vị trí bố trí;

- Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp. Ủ ở nhiệt độ 37°C (4.2.2) trong 30 min;

- Sau 30 min ủ đĩa, đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với lượng 300 ml/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X;

...

...

...

- Sau đó đỗ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với các lượng 300 ml/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X;

- Nhỏ 100 ml cơ chất vào các giếng, ủ đĩa trong 15 min ở nhiệt độ phòng;

- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng vào các giếng.

6.2.5  Đọc kết quả

- Đọc đĩa ở bước sóng 650 nm bằng máy đọc ELISA (4.2.1) và tính kết quả.

- Phản ứng được công nhận khi:

+ mật độ quang học (OD) của đối chứng âm ≤ 0,15

+ OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm ≥ 0,15

- Đánh giá kết quả:

...

...

...

(OD của mẫu - OD của đối chứng âm)

(OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm)

+ Mẫu dương tính: S/P ≥ 0,4

+ Mẫu âm tính: S/P < 0,4

CHÚ THÍCH: Đối với những mẫu nghi ngờ phải làm lại để khẳng định, nếu vẫn nghi ngờ thì dựa vào dịch tễ học để kết luận bệnh.

7  Kết luận

Lợn được kết luận mắc bệnh tiêu chảy ở lợn do virus corona (PED) khi có các đặc điểm về triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với virus PED hoặc dương tính kháng thể PED bằng các phương pháp trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

...

...

...

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thử

A.1  Dung dịch kháng khuẩn

A.1.1  Thành phần

Penicillin

1 000 000 UI

Mycostatin

250 000 UI

Streptomycin

200 mg

...

...

...

1 000 000 UI

Nước cất

10 ml

A.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan kháng sinh bằng nước cất rồi lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 mm. Bảo quản ở âm 20 °C (4.1.2).

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,2

A.2.1  Thành phần

Natri clorua (NaCI)

8 g

...

...

...

0,2 g

Dinatri hidrophosphat (Na₂HPO₄)

1,15 g

Kali dihidrophosphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước cất

1 000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 N hoặc dung dịch axit clohydric (HCl) 1 N. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C (4.1.3).

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Chuẩn bị tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây tạp chéo và ảnh hưởng đến cơ thể nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Tách chiết ARN theo quy trình của kit Invitrogen (Cat No. 74106): thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

Chuẩn bị dung dịch RLT (600 ml/mẫu) vào ống ly tâm 50 ml. Thêm 1/100 β-mercaptoetanol (β-ME) vào dung dịch RLT (dung dịch này có thể bảo quản 1 tháng ở nhiệt độ phòng).

B.2  Cách tiến hành

Dùng huyễn dịch đã xử lý (6.1.3) để tách chiết ARN. Có thể sử dụng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep) theo quy trình dưới đây.

...

...

...

- Thêm 500 ml etanol 70 % thể tích (3.1.1) vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn Vortex (4.1.6).

- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5) ở nhiệt độ phòng.

- Bổ sung 700 ml dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm lạnh (4.1.5), thay ống thu mới vào cột lọc.

- Nhỏ 500 ml dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5), thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở gia tốc tối đa, bỏ ống thu.

- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 ml nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5), bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở âm 70 °C bằng tủ lạnh âm sâu (4.1.2) hoặc nhiệt độ thấp hơn.

Phụ lục C

...

...

...

Sơ đồ bố trí mẫu trong đĩa ELISA xét nghiệm kháng thể virus corona (PED)

1

2

3

4

5

6

7

...

...

...

9

10

11

12

A

NC

S5

S13

S21

...

...

...

S37

S45

S53

S61

S69

S77

S85

B

NC

...

...

...

S14

S22

S30

S38

S46

S54

S62

S70

S78

...

...

...

C

PC

S7

S15

S23

S31

S39

S47

S55

...

...

...

S71

S79

S87

D

PC

S8

S16

S24

S32

...

...

...

S48

S56

S64

S72

S80

S88

E

S1

S9

...

...

...

S25

S33

S41

S49

S57

S65

S73

S81

S89

...

...

...

S2

S10

S18

S26

S34

S42

S50

S58

S66

...

...

...

S82

S90

G

S3

S11

S19

S27

S35

S43

...

...

...

S59

S67

S75

S83

S91

H

S4

S12

S20

...

...

...

S36

S44

S52

S60

S68

S76

S84

S92

CHÚ THÍCH:      NC: đối chứng âm

...

...

...

S1 đến S92: mẫu kiểm tra

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] O. Kim, C. Chae (1999) Application of reverse transcrption polymerase chian reaction to detect porcine epidemic dianrhea virus in Vero cell culture, J Vet Diagn Invest 11:537-538 (1999)

[2] F. Guscetti (1998), Immunohistochemical Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Compare to Other Methods, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998, 5(3):412.

[3] Pan et al (2012), Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China, Virology Jounal 2012, 9:195.

[4] Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Kamphangsaen campus, Nakornphathom: Recurrent of Porcine Epidemic Diarrhea Outbreak in a Pig Farm: A case Report Pariwat Poolperm, Preeda Lertwatcharasarakul, Sakuna Phattanakunanan, Kitcha Urairong, THAILAND 73140, Pariwat.P@ku.ac.th

[5] Leyi Wang, Yan Zhang: Beverly Byrum: Development and evaluation of a duplex real-time RT- PCR for detection and differentiation of virulent and variant strains of porcine epidemic diarrhea viruses from the United States. Animal Disease Diagnostic Laboratory, Ohio Department of Agriculture, 8995 East Main Street, Building No. 6, Reynoldsburg, OH 43068, United States

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-38:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do coronavirus