6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh viêm phổi địa phương ở lợn

6.1.1. Lấy mẫu

Chọn lợn nghi bệnh mổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau:

- Phổi: lấy phần phổi nghi có bệnh tích ở thùy tim, thùy đỉnh, thùy hoành hai bên với độ dày lát cắt khoảng 0,5 cm và độ rộng khoảng 1 cm đến 2 cm, độ dài khoảng 1 cm đến 2 cm;

- Hạch phổi: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm.

Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa formalin (3.1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin có tỷ lệ khoảng 1 : 10, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.1.2. Bảo quản mẫu

...

...

...

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

- Mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formalin (3.1.1) thời gian 24 h;

- Cắt các bệnh phẩm đã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.2.1).

6.1.4. Cách tiến hành

6.1.4.1. Đúc khuôn

- Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) thời gian từ 2 đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

...

...

...

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy chuyển mẫu mô tự động (4.1.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

- Đúc khuôn: rót parafin (3.1.6) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.1.4.2. Cắt tiêu bản

- Cắt gọt khối parafin (6.1.4.2) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.2.5);

- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 µm đến 5 µm, cắt một vài lát;

...

...

...

6.1.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới với nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;

...

...

...

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.2.11).

6.1.5. Đọc kết quả^[3]

Đặc điểm bệnh tích vi thể của bệnh là viêm phổi ở thể mạn tính với đặc trưng các tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân xâm nhập vùng xung quanh phế quản, tiểu phế quản và mạch quản. Bệnh tích lan rộng tới cả các nang lympho xung quanh phế quản. Các nang lympho có dạng trung tâm sinh trưởng.

- Giai đoạn đầu của bệnh: thường thấy các tế bào bạch cầu đơn nhân lớn tập trung trong lòng phế quản;

- Có thể quan sát thấy viêm kẽ phổi, vách phế nang dày do xâm lấn của số lượng lớn các tế bào đơn nhân và đa nhân;

- Trong lòng phế nang có chứa các mảnh tế bào;

- Các phế nang có thể chứa dịch phù màu hồng, hoặc xẹp xuống hoặc khí thũng.

6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae

6.2.1. Lấy mẫu

...

...

...

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.2.1) được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C). Mẫu được gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu mẫu chưa xét nghiệm ngay phải được bảo quản trong tủ âm 20 °C (4.1.1).

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Mẫu bệnh phẩm phổi: lấy khoảng 1 g phổi (6.2.1), cắt nhỏ rồi nghiền thành huyễn dịch với dung dịch PBS (3.2.5) theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích) trong cối chày sứ (4.3.3). Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (4.3.2) ở gia tốc 3 000 g trong 5 min. Hút lấy dịch nổi để tiến hành tách chiết ADN cho phản ứng realtime PCR.

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy Blood tissue (Cat. No. 69506)[1]⁾ (xem Phụ lục B).

...

...

...

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của Mycoplasma hyopneumoniae sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.3) được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Cặp mồi, mẫu dò^[4]

Mẫu dò, mồi

Trình tự từ 5’ đến 3'

Mẫu dò

FAM - CCGGAATTGATAGCTCAAATTACGAA - BHQ1

Mồi xuôi

TGCCGGTGAATGTTTCTG

Mồi ngược

...

...

...

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 µM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 µl mồi gốc và 80 µl nước (3.2.8));

- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 µM: pha loãng mẫu dò gốc bằng nước (3.2.8) (6 µl mẫu dò gốc và 94 µl nước (3.2.8)).

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Bảng Invitrogen Platinum One - Step qPCR SuperMix - UDG (Cat. No. 11730-017) [2]⁾ thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 3.

Bảng 3 - Thành phần phản ứng realtime PCR

...

...

...

Thể tích

µl

Nước tinh khiết không có nuclease

6,0

PCR SuperMix

12,5

Mồi xuôi (20 µM)

0,5

Mồi ngược (20 µM)

...

...

...

Mẫu dò (6 µM)

0,5

Tổng thể tích

20,0

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 µl mẫu ADN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 µl mẫu ADN (phụ lục B) vào ống phản ứng.

CHÚ Ý:

...

...

...

- Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (4.3.1) đã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong Bảng 4.

Bảng 4 - Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

50 °C

2 min

1 vòng

...

...

...

5 min

95 °C

10 s

40 vòng

60 °C

50 s

40 vòng

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.3.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền)

...

...

...

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

6.3. Phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae bằng phương pháp ELISA

6.3.1. Lấy mẫu

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22G (hoặc 20G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi địa phương nhưng chưa tiêm phòng vắc xin. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

CHÚ THÍCH: Không lấy mẫu huyết thanh lợn đã được tiêm vắc xin Mycoplasma hyopneumoniae để xét nghiệm kháng thể vì phương pháp trong tiêu chuẩn này không phân biệt được kháng thể nhiễm tự nhiên và kháng thể do tiêm vắc xin.

6.3.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh của lợn nghi mắc bệnh (6.3.1) được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong trường hợp mẫu đến phòng thí nghiệm chưa được xét nghiệm ngay, phải được ly tâm bằng máy ly tâm (4.3.2), chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh (4.1.2).

6.3.3. Chuẩn bị mẫu

...

...

...

6.3.4. Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae ở lợn của hãng IDEXX[3]⁾

6.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu

- Nguyên liệu: các nguyên liệu của bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, trước khi tiến hành phản ứng phải được đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 °C đến 26 °C);

- Mẫu huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/40 với Sample Dilution (dung dịch pha loãng mẫu). (Lấy 10 µl huyết thanh pha với 390 µl dung dịch pha loãng mẫu);

- Pha loãng dung dịch Wash Concentrate 10 X (dung dịch rửa): lấy 1 phần dung dịch rửa 10 X pha với 9 phần nước cất;

- Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 µl/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng;

- Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control - NC), kiểm chứng dương (Positive Control - PC).

6.3.4.2. Tiến hành phản ứng ELISA

...

...

...

- Nhỏ 100 µl dung dịch pha loãng mẫu vào giếng mẫu trắng;

- Nhỏ 100 µl mẫu kiểm chứng âm vào giếng kiểm chứng âm;

- Nhỏ 100 µl mẫu kiểm chứng dương vào giếng kiểm chứng dương;

- Nhỏ 100 µl mẫu huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng 1/40 vào các giếng thích hợp;

- Để dĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

- Nhỏ 300 µl dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại 3 lần.

Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể

- Nhỏ 100 µl dung dịch kết hợp vào các giếng;

...

...

...

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

- Nhỏ 300 µl dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại 3 lần.

Bước 3: Nhỏ cơ chất

- Nhỏ 100 µl dung dịch cơ chất TMB (Tetramethylbenzidine) vào các giếng;

- Để đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 min.

Bước 4: Dừng phản ứng

- Nhỏ 100 µl dung dịch dừng phản ứng (Stop solution) vào các giếng;

- Đo giá trị mật độ quang học (OD) bằng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm.

6.3.5. Đọc kết quả

...

...

...

- Giá trị OD của kiểm chứng dương trừ giá trị OD của kiểm chứng âm phải lớn hơn hoặc bằng 0,15;

- Giá trị OD của kiểm chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15.

Tính kết quả:

- Trung bình của kiểm chứng âm: (NC1 + NC2) / 2= NCx tb

- Trung bình của kiểm chứng dương: (PC1 + PC2) / 2 = PCx tb

- Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu – NCx tb) / (PCx tb – NCx tb)

- Hiệu giá của mẫu: Log₁₀ Titer = 1.09 (log₁₀ S/P) + 3.36

CHÚ THÍCH: S/P là tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của mẫu bệnh phẩm so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng dương.

Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:

...

...

...

- Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae có S/P nhỏ hơn 0,30;

- Mẫu huyết thanh nghi ngờ có kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae có S/P trong khoảng từ 0,30 đến 0,40 và phải được kiểm tra lại.

7. Kết luận

Lợn được xác định mắc bệnh viêm phổi địa phương khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, triệu chứng bệnh tích đặc trưng của bệnh và dương tính với một trong các phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.1. Thành phần

...

...

...

9,47 gm

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

9,08 gm

Nước cất

900 ml

A.2. Chuẩn bị

...

...

...

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít QIAGEN RNeasy Blood & Tissue kit (Cat. No. 69506) như sau:

B.1. Pha dung dịch

- Dung dịch AW1: thêm 125 ml etanol tuyệt đối (3.2.4) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;

...

...

...

B.2. Cách tiến hành

- Cho 20 µl protease vào ống 1,5 ml;

- Chuyển 200 µl dịch mẫu (dịch nổi xử lý ở 6.2.3) vào ống 1,5 ml;

- Thêm 200 pl dung dịch AL (lysis buffer) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s, sau đó ly tâm (4.3.2) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm (4.3.2) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Cho 200 µl etanol tuyệt đối (3.2.4) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s, sau đó ly tâm (4.3.2) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Chuyển 620 µl dung dịch mẫu đã tách chiết vào cột lọc (spin column) với ống thu (collection tube);

- Ly tâm (4.3.2.) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 µl dung dịch AW1 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

...

...

...

- Cho cột lọc vào ống thu mới;

- Thêm 500 µl dung dịch AW2 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 ml;

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml mới

- Bảo quản mẫu ADN ở 4 °C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime PCR ngay và giữ ở âm 20 °C để lưu mẫu trong thời gian dài.

...

...

...

[1] JICA, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Third edition, p.110-111

[2] J.Quinn, M.E.Carter, B.Markey, G.R.Carter, 2004. Veterinary Clinical Microbiology. 6th Edition. Printed in Spain, p.320-326.

[3] Eileen L. Thacker, 2006. Chapter 42: Mycoplasmal Disease. Diseases of Swine. 9th Edition. Blackwell Publishing, p.701-707.

[4] Steven B. Kleiboeker, 2004. Development of Real-time, multiplex PCR/RT-PCR assays for improved PRDC pathogen detection - NPB. Available at: http://www.pork.org/FileLibrary/ResearchDocuments/03-114-KLEIBOEKER.6-28-04.pdf.

[5] IDEXX Laboratories, Herd Chek^® Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit.

[6] Nguyễn Vinh Phước, 1978. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc.

[7] Lê Văn Lãnh và cs, 2012. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y.

[8] Barbara E. Straw và cs, 2006. Diseases of swine.

[9] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Đại Học Nông Nghiệp.

...

...

...

[11] Mycoplasmal Pneumonia in Pigs. Available at: http://www.thepigsite.com/pighealth/article/323/enzootic-pneumonia-ep-or-mycoplasma-hyopneumoniae-infection.

[12] M. Kobisch and N.F. Friis, “Swine mycoplasmoses”, Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1996, 15 (4), 1569-1605. Available at: http://www.oie.int/doc/ged/D9110.PDF.

[1] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[2] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-37:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn