Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.3) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi và mẫu dò lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi, mẫu dò ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM, pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.4) (20 ml mồi gốc và 80 ml nước);

- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 10 mM, pha loãng mẫu dò gốc bằng nước (3.2.4) (10 ml mẫu dò gốc và 90 ml nước).

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của QuantiTect Probe PCR, Qiagen (Cat No. 204341) 2⁾

Thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng 2.

...

...

...

Thành phần

Thể tích

ml

QuantiTect Probe PCR master mix

12

Mồi xuôi, 20 mM

1

Mồi ngược, 20 mM

1

...

...

...

0,5

Nước tinh khiết không có nuclease

5,5

Tổng thể tích

20

Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ADN có giá trị chu kì ngưỡng (C_t) đã biết trước vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước (3.2.4) vào ống phản ứng;

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ADN bệnh phẩm (6.2.4.1) vào ống phản ứng.

...

...

...

- Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng Realtime PCR bằng máy nhân gen (Realtime PCR) (4.3.2) đã được cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

95 °C

10 min

...

...

...

95 °C

45 s

45

60 °C

1 min

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy nhân gen (realtime PCR) (4.3.2) dựa trên giá trị C_t (C_t là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền);

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị C_t biết trước, mẫu kiểm chứng âm tính không có C_t;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị C_t ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < C_t ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

...

...

...

6.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể biên trùng

6.3.1. Lấy mẫu

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 20G (hoặc 18G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi của trâu bò nghi mắc bệnh biên trùng. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.3.2. Bảo quản mẫu

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1).

6.3.3. Chuẩn bị mẫu

Chắt huyết thanh từ xylanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.3.4. Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể biên trùng ở trâu bò của hãng SVANOVA3).

...

...

...

- Dung dịch đệm: pha loãng PBS-Tween 20 X với nước cất theo tỷ lệ 1/20 (cho 25 ml dung dịch PBS-Tween 20 X vào 475 ml nước cất), lắc đều. Bảo quản dung dịch đệm ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C;

- Dung dịch kháng kháng thể bò: pha loãng kháng kháng thể bò với 11,5 ml dung dịch đệm (pha xong dùng ngay). Sau khi pha loãng bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Dung dịch kháng kháng thể bò đông tan tối đa 3 lần;

- Pha loãng mẫu kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm (6.3.3) với dung dịch đệm theo tỷ lệ 1/40 (cho 10 ml mẫu kiểm chứng hoặc mẫu bệnh phẩm vào 390 ml dung dịch đệm).

6.3.4.2. Tiến hành phản ứng

- Các thuốc thử để ở nhiệt độ phòng từ 18 °C đến 25 °C trước khi sử dụng;

- Nhỏ 100 ml mẫu kiểm chứng (âm, dương) đã pha loãng (6.3.4.1) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện trên 2 giếng, vị trí của mẫu kiểm chứng đã được đánh dấu trong đĩa);

- Nhỏ 100 ml mẫu bệnh phẩm đã pha loãng (6.3.4.1) vào giếng được chọn (mỗi mẫu có thể làm 1 giếng hoặc 2 giếng, tuy nhiên trong trường hợp xác định lại mỗi mẫu nên làm 2 giếng);

- Phủ kín đĩa và ủ ở tủ ấm 37 °C (4.4.1) trong vòng 30 min;

- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm (6.3.4.1);

...

...

...

- Phủ kín đĩa ủ ở tủ ấm 37 °C (4.4.1) trong 30 min;

- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm;

- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất vào mỗi giếng;

- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng từ 18 °C đến 25 °C trong 30 min;

- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng;

- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng từ 18 °C đến 25 °C trong 30 min;

- Đọc đĩa ở bước sóng 405 nm bằng máy đọc ELISA (4.4.2) trong vòng 15 min.

6.3.5. Đọc kết quả

- Tính giá trị mật độ quang học (OD) của mẫu kiểm chứng âm, mẫu kiểm chứng dương và mẫu bệnh phẩm.

...

...

...

PP =

OD mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm

x 100

OD mẫu kiểm chứng dương

- Giá trị mẫu kiểm chứng nằm trong khoảng giới hạn sau:

1) OD của mẫu kiểm chứng dương: lớn hơn khoảng giá trị từ 0,9 đến 2,3;

2) PP của mẫu kiểm chứng âm: nhỏ hơn 20.

- Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:

1) PP nhỏ hơn 25: mẫu âm tính;

...

...

...

CHÚ THÍCH: Kít phát hiện kháng thể biên trùng không thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng thể do tiêm vắc xin.

6.4. Phương pháp CAT phát hiện kháng thể biên trùng

6.4.1. Lấy mẫu

Xem 6.3.1.

6.4.2. Bảo quản mẫu

Xem 6.3.2.

6.4.3. Chuẩn bị mẫu

Xem 6.3.3.

6.4.4. Cách tiến hành

...

...

...

Gây nhiễm qua đường tĩnh mạch bằng máu có chứa Anaplasma spp. vào con bê cắt lách. Lấy máu của con vật kiểm tra, nếu 50% máu con vật nhiễm Anaplasma spp. thì đem rửa, ly giải và ly tâm (4.3.1) để thu hồi Anaplasma spp. ở dạng viên. Phần kháng nguyên dạng viên sau khi đánh tan, rửa và cho vào dung dịch thuốc nhuộm để tạo huyễn dịch kháng nguyên cuối cùng.

6.4.4.2. Tiến hành phản ứng

- Các thuốc thử để ở nhiệt độ từ 25 °C đến 26 °C trước khi sử dụng;

- Trên mỗi vòng tròn của bản nhựa: nhỏ 10 ml huyết thanh bò không bị nhiễm Anaplsama (nồng độ conglutinin cao), 10 ml mẫu bệnh phẩm (6.4.3) và 5 ml kháng nguyên (6.4.4.1). Mẫu kiểm chứng âm và dương cũng được thực hiện trên mỗi bản nhựa.

- Trộn các thành phần đã cho vào vòng tròn bản nhựa bằng đũa thủy tinh. Sau khi trộn mỗi phản ứng, rửa sạch đũa thủy tinh để tránh tạp sang mẫu khác;

- Đặt bản nhựa kiểm tra trên máy lắc (4.5) với tốc độ từ 100 r/min đến 110 r/min trong 7 min.

6.4.5. Đọc kết quả

- Nếu phát hiện đám kết tủa: mẫu dương tính;

- Nếu không có đám kết tủa: mẫu âm tính.

...

...

...

7. Kết luận

Trâu bò được kết luận là mắc bệnh biên trùng khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm kháng nguyên hoặc kháng thể dương tính bằng một trong những phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử cho phương pháp nhuộm Giemsa

A.1. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0

A.1.1. Thành phần

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)                                                  9,47 g

...

...

...

Nước cất                                                                                  900 ml

A.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2. Dung dịch Giemsa, 10 %

Dung dịch Giemsa (azur-eosin-methylen blue)                             1 phần

Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,0 (A.1)                                          9 phần

CHÚ THÍCH: Nồng độ dung dịch Giemsa có thể thay đổi theo các phòng thí nghiệm.

...

...

...

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) như sau:

B.1. Pha dung dịch

- Dung dịch AW 1 (Wash buffer 1): thêm 125 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;

- Dung dịch AW 2 (Wash buffer 2): thêm 160 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc.

B.2. Cách tiến hành

- Bước 1: nhỏ 20 ml proteinase K vào ống 1,5 ml; nhỏ thêm 100 ml mẫu máu (6.2,3); và thêm dung dịch PBS để được thể tích 220 ml. Tiến hành tiếp bước 2;

...

...

...

- Bước 3: nhỏ 200 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.3).

- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 ml dung dịch AW 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 ml dung dịch AW 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 3 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml hoặc 2 ml sạch;

- Bước 8: nhỏ 50 ml dung dịch AE (Elution buffer) vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min

- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa ADN;

Bảo quản ADN ở tủ lạnh (4.1.2) nếu thực hiện phản ứng realtime PCR ngay hoặc ở tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu thực hiện phản ứng realtime PCR sau 24 h.

...

...

...

[1] Carelli G., Decaro N., Lorusso A., Elia G., Lorusso E., Mari V., Ceci L and Buonavoglia C. (2007). Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR. Vet. Microbiol., 124, 107-114.

[2] A. marginale Antibody Test. Available at: http://www.svanova.com/content/dam/internet/ah/svanova/dk_EN/documents/Kit%20inserts/lnsert%20A%20marginale%2019-2960-00_04.pdf.

[3] Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996, Giáo trình ký sinh trùng thú y. NXB Đại học Nông nghiệp I, 243-244.

[4] Reinbold J.B., Coetzee J.F., Sirigireddy K.R & Ganta R.R (2010). Detection of Anaplasma marginale and A. phagocytophilumin bovine peripheral blood samples by duplex real-time reverse transcriptase PCR assay. J.CIin. Microbiol., 48, 2424-2432.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. Tuy nhiên, thành phần và thể tích của phản ứng realtime PCR có thể thay đổi phù hợp với từng phòng thí nghiệm

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-34:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò