6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh Gumboro

6.1.1. Lấy mẫu

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà nghi mắc bệnh mổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau:

- Túi Fabricius: cắt ngang túi;

- Lách: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm;

- Hạch ruột vùng đầu manh tràng: cắt toàn bộ hạch.

Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa formalin (3 1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin có tỷ lệ khoảng 1:10, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tể, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

...

...

...

Mẫu bệnh phẩm đảm bảo ngập trong formalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi formalin ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, băng dính gói kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới formalin (3.1.1), đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1:10.

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

- Mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formalin (3.1.1) thời gian 24 h;

- Cắt các bệnh phim đã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.2.1).

6.1.4. Cách tiến hành

6.1.4.1. Đúc khuôn

- Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

...

...

...

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 2 , thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy chuyển mẫu mô tự động (4.2.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

- Đúc khuôn: rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt chuyên dụng (4.2.4), gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.1.4.2. Cắt tiêu bản

- Cắt gọt khối parafin (6.1.4.1) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.2.5);

...

...

...

- Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C. Dùng phiến kính (4.2.8) vớt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.1.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

...

...

...

- Rửa dưới vòi nước chảy làm sạch eosin (3.1.5) còn bám trên phiến kính;

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kinh hiển vi quang học (4.2.11).

6.1.5. Đọc kết quả^[1]

- Mẫu lấy vào giai đoạn đầu của quá trình viêm: cấu trúc các nang lympho của túi Fabricius không còn rõ hình đa giác, chuyển sang hình tròn hoặc hình ovan, vách ngăn các nang giãn rộng, phù, xuất huyết, có sự xâm nhập của các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào lympho hoại tử. Tế bào lưới nội mô tăng sinh;

- Mẫu lấy vào giai đoạn phản ứng viêm giảm: nang túi Fabricius tăng sinh các tế bào biểu mô phần giữa lớp vỏ và tủy;

- Lách, hạch lympho manh tràng có các tế bào lympho bị hoại tử.

6.2. Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện virus Gumboro

6.2.1. Lấy mẫu

Chọn 3 đến 5 con gia cầm nghi bệnh, mổ lấy từ 3 g đến 5 g túi Fabricius cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

...

...

...

Mẫu bệnh phẩm virus: được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 ^oC đến 8 ^oC). Mẫu được gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu mẫu chưa xét nghiệm ngay phải được bảo quản trong tủ âm 20 °C (4.1.1).

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lấy 1 g mẫu mô túi Fabricius, cắt nhỏ rồi nghiền thành huyễn dịch với dung dịch PBS (3.2.5) theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích) trong cối chày sứ (4.3.3). Ly tâm (4.3.2) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ARN cho phản ứng realtime RT-PCR.

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy miniKit (Cat. No.74104)1) (xem Phụ lục B)

6.2.4.2. Chuẩn bị mồi và mẫu dò

...

...

...

Bảng 2 - Trình tự cặp mồi và mẫu dò^[2]

Mẫu dò, mồi

Trình tự từ 5’ đến 3’

Mẫu dò

FAM-TCTTTTTCCCTGGATTCCCTGGCTCA-TAMRA

Mồi xuôi

GGACACAGGGTCAGGGTCAAT

Mồi ngược

GCAGTGTGTAGTGAGCACCCA

...

...

...

- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 ml mồi gốc và 80 ml nước (3.2.8));

- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (6 ml mồi gốc và 94 ml nước(3.2.8)).

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR system (Cat # 11732 - 020)2), thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Thành phần phản ứng

Thành phần

...

...

...

Reaction Mix 2X

12,5

Hỗn hợp Enzym (Enzyme mix)

0,5

Mồi/ mẫu dò

1,5

Nước tinh khiết không có nuclease

5,5

Tổng thể tích

...

...

...

Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ARN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ARN (phụ lục B) vào ống phản ứng.

CHÚ Ý:

- Phản ứng realtime RT-PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương, mẫu kiểm chứng âm.

- Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (4.3.1) đã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong bảng 4.

Bảng 4 - Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ

50 °C

15 min

1

95 °C

2 min

95 °C

10 s

...

...

...

60 °C

30 s

40

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.3.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền)

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

6.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Gumboro

...

...

...

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu tĩnh mạch cánh hoặc máu tim của gà nghi mắc bệnh nhưng chưa tiêm phòng vắc xin. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.3.2. Bảo quản mẫu

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1).

6.3.3. Chuẩn bị mẫu

Chắt huyết thanh từ xy lanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.3.4. Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Gumboro (Infectious Brusal disease test kit) của hãng IDEXX3)

6.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu

- Các nguyên liệu của bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, trước khi tiến hành phản ứng phải được đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 °C đến 26 °C);

...

...

...

- Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 10 lần (Wash Concentrate 10 X): lấy 1 phần nước rửa đậm đặc pha với 9 phần nước cất;

- Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 ml/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng;

- Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control - NC), kiểm chứng dương (Positive Control - PC).

6.3.4.2. Tiến hành phản ứng

Bước 1: Nhỏ huyết thanh

- Nhỏ 100 ml dung dịch pha loãng mẫu vào giếng có mẫu trắng (Blank);

- Nhỏ 100 ml kiểm chứng âm không pha loãng vào hai giếng đối chứng âm;

- Nhỏ 100 ml kiểm chứng dương không pha loãng vào hai giếng đối chứng dương;

- Nhỏ 100 ml huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng vào các giếng thích hợp;

...

...

...

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

- Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.

Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể (conjugate)

- Nhỏ 100 ml dung dịch kháng kháng thể vào các giếng;

- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

- Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.

Bước 3: Nhỏ cơ chất

- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất TMB vào các giếng;

...

...

...

Bước 4: Dừng phản ứng

- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào các giếng;

Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm.

6.3.5. Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Giá trị OD của đối chứng dương trừ giá trị OD của đối chứng âm phải lớn hơn 0,075;

- Giá trị OD của đối chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15.

Tính kết quả:

- Trung bình của đối chứng âm: [NC1 A (650) + NC2 A(650)] / 2 = NC x tb

...

...

...

- Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu - NC x tb) / (PCx tb - NC x tb)

- Hiệu giá của mẫu: log₁₀ Titer = 1,09 (log₁₀ S/P) + 3,36

CHÚ THÍCH: S/P là tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của mẫu bệnh phẩm so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng dương.

Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:

- Mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể Gumboro có S/P lớn hơn hoặc bằng 0,20;

- Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Gumboro có S/P nhỏ hơn 0,20.

7. Kết luận

Gia cầm được xác định mắc bệnh Gumboro khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể đặc trưng của bệnh và dương tính với một trong các phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này.

...

...

...

(Quy định)

Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.1. Thành phần

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)              9,47 gm

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)              9,08 gm

Nước cất                                              900 ml

A.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ARN sử dụng kít QIAGEN RNeasy miniKit (CAT. No. 74104) như sau:

- Lấy 600 ml dung dịch RLT (lysis buffer) vào ống 1,5 ml;

- Lấy 200 ml mẫu (dịch nổi được xử lý ở 6.2.3) vào ống có chứa dung dịch RLT. Lắc ống bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s;

- Cho tiếp 400 ml etanol tuyệt đối (3.2.4) vào ống. Lắc ống bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s;

- Chuyển 600 ml dung dịch sang cột lọc (dùng cho tách chiết ARN) đựng trong ống thu, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s;

...

...

...

- Lấy 700 ml dung dịch RW1 nhỏ vào cột lọc, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s. Đỗ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống;

- Lấy 500 ml RPE nhỏ vào cột lọc, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s: Đổ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống. Lặp lại bước này 1 lần nữa;

- Chuyển cột lọc sang ống thu mới. Ly tâm (4.3.2) cột lọc với gia tốc 12 000 g trong 2 min;

- Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml sạch Rnase;

- Nhỏ 50 ml nước sạch Rnase vào cột lọc, ủ trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 10 000 g trong 1 min;

- Bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml có chứa ARN;

- Cất mẫu ARN ở 4 °C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime RT-PCR ngay và bảo quản ở âm 20 °C để lưu mẫu trong thời gian dài.

...

...

...

[1] Thierry van den Berg, 2008. Poultry disease. 6^th Edition. Saunders Elsevier. p.359 - 366.

[2] Judit Iván, Maja Velhner, Krisztina Ursu, Péter Germán, Tamás Mató, Csaba Nick Drén, and János Mészáros, 2005. Delayed vaccine virus replication in chickens vaccinated subcutaneously with an immune complex infectious bursal disease vaccine: Quantification of vaccine virus by real-time polymerase chain reaction, Can J Vet Res. Apr; 69(2): 135-142.

[3] JICA, 2003., Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Third edition. p 163-164.

[4] N.Eterradossi and Y.M.Saif, 2008. Disease of Poultry. 12^th Edition. Blackwell Publishing. p.185-208.

[5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thuý, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Đại Học Nông Nghiệp.

[6] T.P. van den Berg, N. Eterradossi, D. Toquin & G. Meulemans, “Infectious bursal disease (Gumboro disease)”, Rev. sci. tech. Off. int Epiz, 2000, 19 (2), 527-543. Available at: http://www.oie.int/doc/ged/D9315.PDF.

[7] Overview of lnfectious bursal disease in poultry. Available at: http://www.merckmanuals.com/vet/poultry/infectious_bursal_disease/overview_of_infectious_bursal _disease_in_poultry.html

[8] Infectious bursal disease (Gumboro). Available at: http://www.thepoultrysite.com/publications/6/diseases-of-poultry/193/infectious-bursal-disease-gumboro

[9] Thierry van den Berg (2000), Acute infectious bursal disease in poultry: A review, Avian Pathology, Taylor and Francis publishers, p.175-194.

...

...

...

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm