5.2.2.4.3. Hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt

- Chuẩn bị hỗn hợp (master - mix) (ví dụ theo hướng dẫn bộ kit Qiagen của nhà sản xuất) với tổng lượng 50 μl bao gồm KCl 50mM; Tris-HCl 10mM (pH 9.0); Triton X - 100; dNTP 200 mM; MgCl₂ 2,5 mM; mồi xuôi 0,1 mM; mồi ngược 0,1 mM; Taq ADN 1,0 U.

GHI CHÚ: phản ứng PCR phải bao gồm mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

5.2.2.4.4. Điện di sản phẩm PCR

Pha 1,2 g bột agarose (gel) với 100 ml TAE 1 X, rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 °C đến 60 °C), cho tiếp 2 μl etidium bromua vào. Sau đó đổ vào khay và cắm lược. Để gel cứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra.

Đổ đầy dung dịch TAE 1 X vào bể điện di (đến vạch "full level"), đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di. Pha 2 μl đệm tải mẫu với 15 μl của sản phẩm mẫu vừa khuếch đại, mẫu đối chứng dương, âm cho vào giếng của miếng gel.

Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 min đến 40 min. Đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV có bước sóng 590 nm.

5.2.2.4.5. Đọc kết quả

- Mẫu dương tính khi hiển thị vạch sản phẩm giống như đối chứng dương và có kích thước 405 bp với điều kiện đối chứng âm không có vạch sản phẩm xuất hiện;

...

...

...

- Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm. Trường hợp này cần xét nghiệm lại hoặc sử dụng các phương pháp để khẳng định.

5.2.3. Phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA

Hiện nay các kít ELISA thương mại đã có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể sán lá gan trên trâu bò (xem phụ lục C).

CHÚ THÍCH: kít phát hiện kháng thể sán lá gan không thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng thể do tiêm vắc xin.

6. Kết luận

Gia súc được kết luận là mắc bệnh sán lá gan khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh và có kết quả xét nghiệm kháng nguyên hoặc kháng thể dương tính bằng một trong những phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

...

...

...

A.1. Nước muối bão hòa, khối lượng riêng 1,2

Natri clorua (NaCl):

400 g

Nước:

1 lít

...

...

...

A.2 Dung dịch kẽm - muối, khối lượng riêng 1,53

Kẽm clorua (ZnCl₂)

1280 g

Nước

610 ml

...

...

...

Nước muối bão hòa

650 ml

A.3. Dung dịch formol 1 %

Formaldehyd:

1 ml

...

...

...

99 ml

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên sán lá gan

B.1. Chuẩn bị nguyên liệu

- Dung dịch đệm pha loãng mẫu (5 X): pha loãng dung dịch đệm với nước cất đã khử ion theo tỷ lệ 1/5 (cho 20 ml dung dịch đệm 5 X vào 80 ml nước cất đã khử ion);

- Dung dịch rửa (20 X): pha loãng dung dịch rửa với nước cất đã khử ion theo tỷ lệ 1/20 (cho 50 ml dung dịch rửa 20X vào 950 ml nước cất đã khử ion);

...

...

...

- Kháng thể gắn enzyme avidine - peroxidase (50 X): pha loãng kháng thể gắn enzyme avidine - peroxidase với dung dịch đệm đã pha loãng theo tỷ lệ 1/50 (cho 20 μl kháng thể gắn enzyme avidine - peroxidase 50 X vào 980 μl dung dịch đệm đã pha loãng);

- Pha loãng mẫu phân phân cần kiểm tra: dùng cân phân tích (4.5) cân 2 g phân, rồi cho 2 ml dung dịch đệm pha loãng sau khi đã pha loãng. Ly tâm với gia tốc 1 000 g trong 10 min (4.6). Thu lấy phần dịch nổi phía trên.

B.2. Cách tiến hành

- Nhỏ 100 μl mẫu phân đã pha loãng vào 2 giếng. Đối chứng dương cho vào 2 giếng (theo sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên). Phủ đĩa bằng giấy nhôm, giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2h;

- Rửa đĩa ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng;

- Nhỏ 100 μl kháng thể gắn enzyme biotin đã pha loãng vào mỗi giếng, ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 h;

- Rửa đĩa ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng;

- Nhỏ 100 μl kháng thể gắn enzyme avidine - peroxidase đã pha loãng vào mỗi giếng, ủ dĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 h;

- Rửa đĩa ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng;

...

...

...

- Ủ đĩa 10 min ở nhiệt độ phòng;

- Nhỏ 50 μl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng;

- Đọc đĩa ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA (4.7)

B.3. Đọc kết quả

OD =

∆ OD mẫu

x 100

OD mẫu đối chứng dương

Trong đỏ:

...

...

...

- ∆ OD mẫu: giá trị trung bình giữa 2 giá trị OD của mẫu

- ∆OD mẫu đối chứng dương: giá trị trung bình giữa 2 giá trị OD của mẫu đối chứng dương:

1) Mẫu dương tính: OD của mẫu lớn hơn 7,99.

2) Mẫu âm tính: OD của mẫu nhỏ hơn 7,99.

CHÚ THÍCH: với mỗi bộ kit khác nhau thì ngưỡng OD để đánh giá là khác nhau

Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên

1

2

...

...

...

4

5

6

7

8

9

10

11

12

...

...

...

ĐC(+)

M4

M8

M12

M16

M20

M24

M28

M32

...

...

...

M40

M44

B

ĐC(+)

M4

M8

M12

M16

M20

...

...

...

M28

M32

M36

M40

M44

C

M1

M5

M9

...

...

...

M17

M21

M25

M29

M33

M37

M41

M45

D

...

...

...

M5

M9

M13

M17

M21

M25

M29

M33

M37

...

...

...

M45

E

M2

M6

M10

M14

M18

M22

M26

...

...

...

M34

M38

M42

M46

F

M2

M6

M10

M14

...

...

...

M22

M26

M30

M34

M38

M42

M46

G

M3

...

...

...

M11

M15

M19

M23

M27

M31

M35

M39

M43

...

...

...

H

M3

M7

M11

M15

M19

M23

M27

M31

...

...

...

M39

M43

M47

CHÚ THÍCH: các dòng A, C, E, G phủ kháng thể đặc hiệu; các dòng B, D, F, H không phủ kháng thể đặc hiệu

ĐC (+): đối chứng dương (có sẵn trong bộ kit)

Từ M1 đến M47: mẫu xét nghiệm từ số 1 đến số 47.

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

...

...

...

Có thể sử dụng bộ kit có bán sẵn để phát hiện kháng thể sán lá gan có trong mẫu huyết thanh và sữa.

CHÚ THÍCH: do chi phí phát hiện kháng thể sán lá gan bằng phương pháp ELISA cao nên thường dùng trong điều tra huyết thanh học.

C.1. Chuẩn bị nguyên liệu

- Dung dịch rửa (20 X): pha loãng dung dịch rửa với nước cát đã khử ion theo tỷ lệ 1/20 (cho 50 ml dung dịch rửa 20 X vào 950 ml nước cát đã khử ion);

- Kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase (100 X): pha loãng kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase với dung dịch đệm 1 theo tỷ lệ 1/100 (cho 10 μl kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase 100 X vào 990 μl dung dịch đệm 1);

- Pha loãng mẫu:

1) Đối với mẫu đối chứng và đối chứng dương cần pha loãng theo tỷ lệ 1/20 bằng dung dịch đệm 2);

2. Đối với mẫu huyết thanh kiểm tra: pha loãng mẫu huyết thanh cần kiểm tra theo tỷ lệ 1/20 bằng dung dịch đêm 2 (cho 10 μl huyết thanh cần kiểm tra (cho 10 μl mẫu huyết thanh cần kiểm tra vào 190 μl dung dịch đệm 2);

C.2. Cách tiến hành

...

...

...

- Nhỏ vào bốn giếng, mỗi giếng 200 μl đối chứng dương đã pha loãng;

- Nhỏ vào hai giếng, mỗi giếng 200 μl huyết thanh cần kiểm tra đã pha loãng;

- Hoặc nhỏ vào hai giếng, mỗi giếng 200 μl mẫu sữa không pha loãng (theo sơ đồ, đĩa. phản ứng ELISA phát hiện kháng thể);

- Lắc đều đĩa; phủ đỉa bằng giấy nhôm hoặc giấy dính, ủ đĩa 1 h ở tủ ấm 37 °C (4.4);

- Rửa đĩa ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng;

- Cho 100 μl kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase đã pha loãng vào từng giếng, phủ đĩa và ủ ở tủ ấm 37 °C (4.4) trong vòng 30 min;

- Rửa đĩa ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng;

- Cho 100 μl TMB vào từng giếng;

- Ủ đĩa ở 21 °C trong 20 min, tránh ánh sáng;

...

...

...

- Lắc đều đĩa cho đến khi có màu đồng nhất;

- Đọc đĩa ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA (4.7)

C.3. Đánh giá kết quả

- OD hiệu chỉnh của mẫu = (OD của giếng phủ kháng nguyên đặc hiệu - OD của giếng chưa phủ kháng nguyên đặc hiệu);

- Kết quả tin cậy nếu thỏa mãn 2 điều kiện sau:

1) Giá trị OD trung bình hiệu chỉnh của đối chứng dương lớn hơn 0,35;

2) Tỷ lệ giữa OD trung bình hiệu chỉnh của đối chứng dương. và OD trung bình hiệu chỉnh của đối chứng âm không nhỏ hơn 3,5.

- Đối với mẫu kiểm tra, tỷ lệ S/P tính như sau:

S/P (%) =

...

...

...

x 100%

OD trung bình hiệu chuẩn của mẫu đối chứng dương

Kết quả S/P (%) được trình bày ở bảng sau:

S/P của mẫu kiểm tra
%

Độ nhiễm
(đối với từng cá thể)

Mức độ nhiễm bệnh
(trong đàn)

Bằng hoặc lớn hơn 150

+++

Nhiễm nặng (lớn hơn 50 % nhiễm)

...

...

...

Lớn hơn 80 đến 150

++

Nhiễm trung bình (từ 20 % đến 50 % nhiễm)

++

Lớn hơn 30 đến 80

+

Nhiễm thấp (ít hơn 20 % nhiễm)

+

Bằng hoặc nhỏ hơn 30

...

...

...

Không nhiễm hoặc nhiễm không đáng kể

0

CHÚ THÍCH: độ nhiễm (đối với từng cá thể)

+++: nhiễm nặng

++: nhiễm trung bình

+: nhiễm thấp

0: không nhiễm hoặc nhiễm không đáng kể

Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng thể

...

...

...

2

3

4

5

6

7

8

9

10

...

...

...

12

A

N

N

M6

M6

M14

M14

M22

...

...

...

M30

M30

M38

M38

B

P

P

M7

M7

...

...

...

M15

M23

M23

M31

M31

M39

M39

C

P

...

...

...

M8

M8

M16

M16

M24

M24

M32

M32

M40

...

...

...

D

M1

M1

M9

M9

M17

M17

M25

M25

...

...

...

M33

M41

M41

E

M2

M2

M10

M10

M18

...

...

...

M26

M26

M34

M34

M42

M42

F

M3

M3

...

...

...

M11

M19

M19

M27

M27

M35

M35

M43

M43

...

...

...

M4

M4

M12

M12

M20

M20

M28

M28

M36

...

...

...

M44

M44

H

M5

M5

M13

M13

M21

M21

...

...

...

M29

M37

M37

M45

M45

CHÚ THÍCH:

Cột 1, 3, 5, 7, 9, 11: phủ kháng nguyên đặc hiệu

Cột 2, 4, 6, 8, 10: không phủ kháng nguyên đặc hiệu

N: đối chứng âm (Có sẵn trong bộ kít)

...

...

...

Từ M1 đến M45: mẫu xét nghiệm từ số 1 đến số 45

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996. Giáo trình ký sinh trùng thú y. Nhà xuất bản Đại học Nông Nghiệp I, trang 53 - 64.

[2]. Marcela A.Cucher et all, Diagnosis of Fasciola hepatica in field-collected Lymnaea. columella. and Lymnaea viatrix snails, Veterinary Parasitology 137 (2006). 74-82PCR

[3]. Levecke B et all, Mixed Giardia duodenalis assemblage A, B, C and E infections in pet chinchillas (Chinchilla lanigera) in Flanders (Belgium). Veterinary Parasitology 2011 Apr 19;177(1-2):166-70. Epub 2010 Nov 21.

[4] http://www.biox.com/Default.aspx?tabid=64&udtid=46

[5] http://www.idexx.com/pubwebresources/pdf/en_us/livestock-poultry/fasciolosis-verification-test- insert.pdf

[6]. http://www.fao.org/wairdocs/ILRI/x5492E/x5492e05.htm

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-27:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 27: Bệnh sán lá gan