Xác định đặc tính sinh hóa theo Phụ lục B.

5.2.4.3. Xác định vi khuẩn Clostridium chauvoei bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt ở Bảng 2.

Bảng 2 - Cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR

Gene đích

Kí hiệu

Sequence (5'-3')

Kích cỡ sản phẩm (bp)

Chu trình nhiệt

...

...

...

23S

1GSC4

GAATTAAAACAACTTTATTAACAAATG

509

94 °C, 5 min ;
Chu trình 30 vòng:
(94 °C, 1 min;
55 °C, 1 min;
72 °C, 1 min)
72 °C - 7 min.
Giữ: 4 °C

rDNA

23UPCH

GGATCAGAACTCTAAACCTTTCT

Tiến hành phản ứng PCR theo Phụ lục C.

...

...

...

Trâu, bò được xác định là mắc bệnh ung khí thán khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn Clostridium chauvoei trong phòng thí nghiệm.

PHỤ LỤC A

(Qui định)

Phương pháp nhuộm gram

A.1. Thuốc nhuộm

A.1.1. Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể

2,0 g

...

...

...

20,0 ml

Amoni oxalat

0,8 g

Nước

80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2. Dung dịch fushcin gốc

Basic fuchsin

1 g

...

...

...

10 ml

Phenol

5 g

Nước

100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỉ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước.

A.1.3. Dung dịch lugol

Kali iodua

2 g

...

...

...

1 g

Nước

200 ml

Nghiền kali iodua và iodua tinh thể, cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Dung dịch tẩy màu

Axeton

1 phần

Etanol 95 %

3 phần

...

...

...

- Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min.

- Rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min.

- Rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ etanol 95 %.

- Rửa nước thật nhanh, để khô

- Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min.

- Rửa nước.

- Thấm khô hoặc sấy khô.

...

...

...

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (xem 4.6).

PHỤ LỤC B

(Qui định)

Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Clostridium chauvoei

B.1. Kiểm tra đặc tính sinh lecithinase và lipase

B.1.1. Môi trường thạch lòng đỏ trứng

Sử dụng môi trường thạch lòng đỏ trứng, có thành phần như sau:

Thạch thường (xem 3.2)

...

...

...

Nước

900 ml

Huyễn dịch lòng đỏ trứng

100 ml

Chuẩn bị huyễn dịch lòng đỏ trứng: Trộn 1 lòng đỏ trứng với 20 ml nước muối sinh lý 0,9 % vô trùng.

Pha thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.4) ở 121 °C 15 min. Để thạch nguội khoảng từ 45 °C đến 50 °C thì bổ sung thêm huyễn dịch lòng đỏ trứng.

Có thể sử dụng các môi trường thương mại.

B.1.2. Cách tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khuẩn lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường thạch lòng đỏ trứng, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí, đọc kết quả sau 48 h.

...

...

...

B.1.3.1. Khả năng sinh lecithinase

- Dương tính: Có quầng mờ đục ở môi trường xung quanh khuẩn lạc;

- Âm tính: Không có quầng mờ đục ở môi trường xung quanh khuẩn lạc.

B.1.3.2. Khả năng sinh lipase

- Dương tính: Có lớp như ngọc trai hay vảy cá bao phủ khuẩn lạc (có thể lan ra xung quanh khuẩn lạc);

- Âm tính: Không có lớp như ngọc trai hay vảy cá bao phủ khuẩn lạc.

B.2. Phản ứng phân giải casein

B.2.1. Môi trường sữa

Thành phần môi trường:

...

...

...

100 g

Nước cất

1000 ml

Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2. Hòa các thành phần trên với nhau, lắc đều và chia ra các ống nghiệm (xem 4.7) (10 ml /1 ống). Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.4) ở 121 °C trong 5 min.

B.2.2. Cách tiến hành

- Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khuẩn lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường sữa.

- Nuôi cấy trong tủ ấm (xem 4.1) trong điều kiện yếm khí, đọc kết quả hàng ngày trong 5 ngày.

B.2.3. Đọc kết quả

- Dương tính: sữa đông vón có vẩn như mây (stormy clot)

...

...

...

- Ghi chú: Kiểm tra phản ứng phân giải casein có thể sử dụng môi trường thương mại sữa Litmus (litmus milk) hoặc môi trường skim milk.

B.3. Phản ứng thủy phân gelatin

B.3.1. Môi trường gelatin

Sử dụng môi trường gelatin có thành phần như sau:

Môi trường nước thịt BHI (xem 3.4)

100 ml

Sodium thioglycolate

0,05 g

Gelatin

...

...

...

Pha 100 ml môi trường nước thịt BHI (xem 3.4) (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Cho thêm gelatin, sodium thioglycolate vào môi trường và đun nóng cho tan. Chỉnh pH 7,0 và chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp tiệt trùng môi trường trong nồi hấp (xem 4.4) ở 115°C trong 15 min.

B.3.2. Cách tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khuẩn lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường gelatin, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điền kiện yếm khí trong thời gian 14 ngày. Cứ từ 2 ngày đến 3 ngày thì để ống vào tủ lạnh 2 h để kiểm tra sự hóa lỏng của môi trường.

B.3.3. Đọc kết quả

- Dương tính: Môi trường bị hóa lỏng;

- Âm tính: Môi trường không bị hóa lỏng.

B.4. Phản ứng sinh hóa đường

B.4.1. Môi trường

Sử dụng môi trường pepton - đường gồm các thành phần:

...

...

...

- Dung dịch bromocrezol 0,2 %: Cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % và lắc cho tan hết.

- Dung dịch đường

Pha đường thành dung dịch 10 %, hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.4) ở 110 °C trong từ 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc 0,45μm.

Chuẩn bị môi trường:

Cho 0,1 ml dung dịch bromocrezol 0,2% vào 100 ml môi trường pepton (xem 3.5), chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.4) ở 121 °C trong 30 min. Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2. Thêm 0,4 ml dung dịch đường 10 %.

B.4.2. Cách tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khuẩn lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường pepton - đường (xem B4.1), nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí, đọc kết quả sau 48 h.

B.4.3. Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển sang màu vàng;

...

...

...

B.5. Khả năng sinh indol

B.5.1. Thuốc thử Kovac's

Paradimetyl aminobenzaldehyt

5 g

Cồn amylic

75 ml

Axit clohydric

25 ml

Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh 4 °C. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml axit clohydric, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục bổ sung axit clohydric.

...

...

...

B.5.2. Cách tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khuẩn lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường pepton (xem 3.5) hoặc môi trường peptone (xem 3.5) có bổ sung tryptophan, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí. Sau 24 h, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac's vào môi trường, lắc nhẹ. Phản ứng dương tính khi có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường (sinh indol). Phản ứng âm tính khi không có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường.

B.3. Phân giải urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (xem 3.8) (chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của nhà sản xuất).

Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khuẩn lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường có urê, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí, đọc kết quả sau 48 h.

- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu tím.

- Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu.

PHỤ LỤC C

...

...

...

Phát hiện vi khuẩn Clostridium chauvoei bằng phương pháp PCR

C.1. Nguyên liệu PCR

C.1.1. Taq PCR Master Mix Kit.

C.1.2. Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2).

C.1.3.Nước tinh khiết không có nuclease.

C.1.4. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

C.1.5. Chất nhuộm màu Ethidi bromua hoặc SYBR green.

C.1.6. Loading dye.

C.1.7. DNA chuẩn (Ladder, marker).

...

...

...

Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là Clostridium chauvoei được cấy trên thạch máu (xem 3.1) và nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí trong 48 h.

Đối chứng dương: Chủng vi khuẩn đã được giám định là Clostridium chauvoei hoặc sử dụng các chủng Clostridium chauvoei chuẩn.

C.3. Tách chiết DNA

Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm, các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại và tiến hành các bước theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

C.4. Phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi (primer) và chu trình nhiệt trong Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:

- Taq PCR Master Mix Kit

12,5 μl

- Mồi xuôi 20 μl

...

...

...

- Mồi ngược 20 μl

1 μl

- Nước không có nuclease

8.5 μl

- Mẫu DNA

2 μl

Tổng thể tích

25 μl

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn Clostridium chauvoei (xem C.2).

...

...

...

C.5. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml.

Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo qui định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR sate DNA gel stain của Invitrogen).

C.6. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương:

Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

...

...

...

Không xuất hiện vạch;

- Mẫu kiểm tra:

Có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương:

Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

- Mẫu đối chứng âm:

Không xuất hiện vạch;

- Mẫu kiểm tra:

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] G.l. Barrow, R.K.A. Feltham, 1993. Cowan and Steel's Mannual for the identification of media bacteria. Third edition.

[2] Sydney M. Finegold, Ellen Jo Baron, 1986. Bailey diagnostic and scott's microbiology. Seventh edition.

[3] E Bagge, S Sternberg Lewerin and K-E Johansson, 2009. Detection and identification by PCR of Clostridium chauvoei in clinical isolates, bovine faeces and substrates from biogas plant. Acta Veterinaria Scandinavica, 51:8

[4] JICA. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Third edition, 2003. 110-111.

[5] Yoshimasa Sasaki, Kinya Yamamoto, Akemi Kojima, Yukie Tetsuka, Mari Norimatsu, Yutaka Tamura, 2000. Rapid and Direct Detection of Clostridium chauvoei by PCR of the 16S-23S rDNA Spacer Region and Partial 23S rDNA Sequences, J. Vet. Med. Sci. 62 (12):1275-1281.

[6] S. Miyashiro, A.F.C. Nassar, M.C.A.M. Souza, J.B. Carvalho, J.E.B. Adegas, 2007. Identification of clostridium chauvoei in clinical samples cultures from blackleg cases by means of pcr. Brazilian Journal of Microbiology 38:491-493.

[7] P.J.Quin, M.E.Cater, B. Markey, G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology.

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-23:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 23: Bệnh ung khí thán