Kiểm tra đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục C.

5.2.5.3. Xác định vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR

Gen đích

Kí hiệu

Trình tự từ đầu 5’ đến 3’

Kích cỡ sản phẩm (bp)

Chu trình nhiệt

...

...

...

rRNA

ER1

CGATTATATTCTTAGCACGCAACG

937

94 °C - 15 min;
Chu trình 30 vòng:
94 °C -1 min;
63 °C - 30 s;
72°C-1 min.
72°C-7min; Giữ: 4 °C

ER2

TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG

Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục D.

6. Kết luận

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

A.1. Thuốc thử

A.1.1. Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C₂₅H₃₀N₃Cl)

2,0 g

...

...

...

20,0 ml

Amoni oxalat [(NH₄)₂C₂O₄.2H₂O]

0,8 g

Nước

80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

...

...

...

Fuchsin basic (C₂₀H₂₀ClN₃)

1 g

Etanol 95 %

10 ml

Phenol (C₆H₆O)

5 g

...

...

...

100ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1:10 (thể tích).

A.1.3. Dung dịch lugol

Kali iodua (KI)

2 g

Iôt (I₂) tinh thể

1 g

...

...

...

Nước

200 ml

Nghiền kali iodua và iôt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Axeton

Etanol 95 %

3 phần

Axeton (C₂H₆O)

...

...

...

A.2. Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản (đã cố định), để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc sấy khô.

A.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi (xem 4.2) với vật kính độ phóng đại 100 lần.

...

...

...

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Giemsa

B.1. Thuốc thử

Dung dịch Giemsa đậm đặc

Giemsa dạng bột

1,0 g

Glyxerin [C₃H₅(OH)₃]

66 ml

...

...

...

Metanol nguyên chất

66 ml

Làm nóng glyxerin đến khoảng 55 °C đến 60 °C trong nồi đun cách thủy. Thêm thuốc nhuộm Giemsa trộn đều và ủ trong 2 h. Sau đó để nguội và thêm cồn methanol vào và giữ trong khoảng 2 tuần trước khi sử dụng.

Khi sử dụng pha loãng theo tỷ lệ 1/10 (phần thể tích) trong dung dịch đệm phosphate 0,01 M (pH = 7,0) và giữ trong 30 min.

Dung dịch đệm phosphate

Dung dịch Natri phosphat, Na₂HPO₄ (9,47 g /l)

hoặc Na₂HPO₄.2H₂O (11,87 g /l)

61,1 ml

...

...

...

Dung dịch Kali phosphat, KH₂PO₄ (9,08 g /I)

38,9 ml

Nước

900 ml

CHÚ THÍCH: có thể sử dụng thuốc nhuộm Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.2. Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản (đã cố định), để trong 20 min đến 30 min, rồi rửa nhanh với nước và sấy khô.

...

...

...

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi (xem 4.2) với vật kính độ phóng đại 100 lần.

PHỤ LỤC C

(Quy định)

Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa

C.1. Kiểm tra đặc tính sinh H2S

C.1.1. Môi trường

Chuẩn bị môi trường TSI hay Kligler(theo hướng dẫn của nhà sản xuất)

Thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI. Thạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, sinh hơi, sinh H₂S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactoza.

...

...

...

Dùng que cấy chích sâu (4.7) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đúng) xuống đáy ống nghiệm chứa môi trường TSI hay Kligler (xem C.1.1), rút dần que cấy lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), kiểm tra sau 24 h đến 48 h.

C.1.3. Đọc kết quả

- Dương tính: đáy ống nghiệm có màu đen;

- Âm tính: đáy ống nghiệm không có màu đen.

C.2. Kiểm tra khả năng phân hủy arginin

C.2.1. Môi trường

Thành phần:

Peptone

4g

...

...

...

L - arginine

0,5 g

Glucose

0,1 g

Chỉ thị màu Bromocresol purple

0,1 ml

...

...

...

100 ml

Chỉnh pH đến 6,0

Dung dịch chỉ thị màu Bromocresol purple

Bromocresol purple

...

...

...

Cồn 90%

100 ml

C.2.2. Tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào môi trường có chứa arginin và chỉ thị màu, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), kiểm tra sau 24 h đến 48 h.

C.2.3. Đọc kết quả

- Dương tính: môi trường chuyển màu tím;

- Âm tính: môi trường có màu vàng (không chuyển màu).

...

...

...

C.3. Phản ứng Catalaza

Nhỏ một giọt dung dịch H₂O₂ 3 % lên phiến kính (xem 4.4).

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào giọt dung dịch H₂O₂ 3 %.

Đọc kết quả sau 5 s như sau:

- Dương tính: có hiện tượng sủi bọt;

- Âm tính: không có hiện tượng sủi bọt.

C.4. Phản ứng Oxidaza

Tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride.

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên mặt giấy đã thấm thuốc thử.

...

...

...

- Dương tính: tại chỗ phết khuẩn lạc có xuất hiện màu tím;

- Âm tính: không xuất hiện màu tím.

C.5. Phản ứng đỏ methyl (Phản ứng MR - Methyl Red)

C.5.1. Môi trường

- Chuẩn bị môi trường VP - MR (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

- Chuẩn bị dung dịch đỏ methyl trong cồn 95 %:

Đỏ methyl

0,04 g

...

...

...

60 ml

Nước

40 ml

C.5.2. Tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào môi trường VP - MR, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h nhỏ vào môi trường nuôi cấy 5 giọt dung dịch đỏ methyl trong cồn 95 %. Đọc kết quả sau 5 min.

C.5.3. Đọc kết quả

- Dương tính: môi trường có màu đỏ;

...

...

...

C.6. Kiểm tra đặc tính di động

Kiểm tra đặc tính di động của vi khuẩn có thể dùng phương pháp giọt treo dưới kính hiển vi (xem 4.2) hoặc cấy vi khuẩn vào môi trường thạch lỏng (semi-solid).

Phương pháp giọt treo dưới kính hiển vi:

Dùng phiến kính (xem 4.4) đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.

Cho một giọt canh khuẩn lên giữa kính phủ vật. Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh khuẩn quay xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính.

Chú ý không giọt canh khuẩn lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm.

Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (xem 4.2) và quan sát ở vật kính độ phóng đại 10 lần hoặc 40 lần.

Trên thị trường hiện nay đã xuất hiện một dụng cụ có tên gọi là vòng O (O-ring) dùng để thực hiện giọt treo mà không cần lam kính lõm. Đây là một miếng đệm hình tròn, có kích thước vòng trong 12 mm, cao 3 mm có thể sử dụng nhiều lần. Khi thực hiện, đặt vòng O lên giữa lam kính thường, đưa giọt canh khuẩn vào một mặt của kính phủ vật, xoay ngược kính phủ vật và úp lên vòng O.

Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn bằng môi trường thạch lỏng:

...

...

...

Cách tiến hành: Dùng que cấy chích sâu (xem 4.7) lấy khuẩn lạc rồi cấy chích sâu vào ống chứa môi trường thạch lỏng trên, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h đọc kết quả.

- Khả năng di động dương tính: Vi khuẩn mọc lan ra xung quanh đường cấy chích sâu.

- Khả năng di động âm tính: Vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấy chích sâu.

PHỤ LỤC D

(Quy định)

Phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR

D.1. Nguyên liệu PCR

D.1.1. Taq PCR Master Mix Kit

...

...

...

D.1.3. Nước tinh khiết không có nuclease

D1.4. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

D.1.5. Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

D.1.6. Loading dye

D.1.7. DNA chuẩn (Ladder, marker)

D.2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu vi khuẩn kiểm tra là vi khuẩn nghi ngờ là E. rhusiopathiae đã nuôi cấy thuần khiết trên môi trường thạch máu (xem 3.2) trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h.

Mẫu vi khuẩn làm đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được giám định là E. rhusiopathiae hoặc sử dụng các chủng E. rhusiopathiae chuẩn.

D.3. Tách chiết DNA

...

...

...

Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Dùng que cấy (xem 4.5) lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 nl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

D.4. Phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae

Sử dụng cặp mồi ở Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:

- Taq PCR Master Mix Kit

12,5 μl

- Mồi xuôi 20 μM

...

...

...

- Mồi ngược 20 μM

1 μl

- Nước không có nuclease

8,5 μl

...

...

...

- Mẫu DNA

2 μl

Tổng thể tích

25 μl

Chu trình nhiệt trong Bảng 2.

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn E. rhusiopathiae (xem D.2).

...

...

...

D.5. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch.

Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian 30 min đến 40 min, ở 100 V.

Sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg /100 ml.

Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo qui định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).

D.6. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

...

...

...

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra không có vạch giống mẫu đối chứng dương.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] JICA. Third edition, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. p.110 - 111.

...

...

...

[3] G.l. Barrow, R.K.A. Feltham. Cowan and Steel's. Mannual for the identification of media bacteria. Third edition, 1993.

[4] Richard L.Wood, Louis M.Henderson, 2006. Chapter 37: Erysipelas. Diseases of Swine. 9th Edition. Blackwell Publishing, p.646-655.

[5] Yoshihiro Shimoji, Yasuyuki Mori, Koji Hyakutake, Tsutomu Sekizaki, Yuichi Vokomizo, 1998. Use of an Enrichment Broth Cultivation-PCR Combination Assay for Rapid Diagnosis of Swine Erysipelas. J Clin Microbiol, 36(1): 86-89.

[6] G.M.Cross and G.J.Eamens, 1993. Erysipelothrix rhusiopathiae infection. Australian Standard diagnostic techniques for animal diseases.

[7] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-20:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn