Phương pháp tiến hành phản ứng sinh hóa xem Phụ lục B

6.2.2.2.1. Giám định gene xác định vi khuẩn S. suis

Phát hiện gene glutamate dehydrogenase (gdh) xác định vi khuẩn S. suis có thể tiến hành bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) (xem phụ lục C).

6.2.2.2.2. Định typ huyết thanh giáp mô của S. suis

Định typ bằng huyết thanh chuẩn: sử dụng kháng huyết thanh chuẩn thương mại và phương pháp tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Định typ bằng bằng phương pháp PCR: có thể dùng phản ứng PCR xác định các typ huyết thanh 1, 2, 1/2, 7, 9 là những typ huyết thanh chủ yếu gây bệnh trên lợn (xem Phụ lục C).

CHÚ THÍCH: Có thể xác định typ huyết thanh bằng phương pháp huyết thanh học hoặc bằng phương pháp PCR.

7. Kết luận

Lợn được xác định là mắc bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra khi:

...

...

...

- Phát hiện được vi khuẩn S. suis thuộc các typ huyết thanh thường gây bệnh trên lợn như: typ 1, typ 2, typ 1/2, typ 3, typ 7, typ 9, typ 14 hoặc nếu vi khuẩn S. suis không thuộc các serotyp thông thường trên nhưng phân lập được từ gan, lách, não hay khớp.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm gram

A.1. Thuốc nhuộm

A.1.1. Dung dịch kết tinh tím

Tím tinh thể

2,0 g

...

...

...

20,0 ml

Amoni oxalat

0,8 g

Nước cất

80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol, hòa tan amoni oxalat trong nước cất. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2. Dung dịch fuscin đậm đặc

Basic fuchsin

1g

...

...

...

10 ml

Phenol (axit phenic)

5g

Nước cất

100ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch mẹ theo tỷ lệ 1/10 với nước cất.

A.1.3. Dung dịch lugol

Kali iodua

2g

...

...

...

1g

Nước cất

200 ml

Nghiền Kali iodua và iodua tinh thể, cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Cồn-axeton

Etanol 95 %

3 phần

Axeton

1 phần

...

...

...

- Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: từ 1 min đến 2 min

- Rửa nước nhanh, để khô

- Nhỏ dung dịch lugol: để 1 min

- Rửa nước nhanh, để khô

- Nhỏ cồn-axeton

- Rửa nước thật nhanh, để khô

- Nhỏ dung dịch fucsin loãng, để 1 min

- Rửa nước

- Thấm khô hoặc sấy khô

...

...

...

- Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.

- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím

- Vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Một số phản ứng sinh hóa

B.1. Khả năng lên men carbonhydrat: lactoza, inulin, salicin, trehaloza, sucroza, sorbitol, manitol và glycerol.

B.1.1. Chuẩn bị môi trường

...

...

...

Chuẩn bị chỉ thị màu andrade:

Axit fucsin        0, 5 g

Nước cất          100 ml

NaOH 1 N         16 ml

Chuẩn bị: Nghiền fucsin, hòa vào nước cất cho tan hết. Cho từ từ lượng NaOH 1 N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 ml đến 17 ml). Để lắng 1 h đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp 120 °C trong 15 min.

Cho 1 ml chỉ thị màu andrade vào 100 ml môi trường nước pepton, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp 120 °C trong 30 min.

Chuẩn bị dung dịch đường: các loại đường pha thành dung dịch 10 % hấp ở 110 °C trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua bộ lọc màng 0,45 mm.

Cho đường vào các ống môi trường: mỗi ống (4 ml) một loại đường riêng rẽ theo tỷ lệ 0,3 ml dung dịch đường 10 %.

Bổ sung huyết bổ sung huyết thanh ngựa (vô trùng) theo tỷ lệ 10 %

...

...

...

Cấy vi khuẩn đã nuôi cấy thuần khiết vào các ống môi trường pepton có đường, để tủ ấm 37 °C sau 24 h đọc kết quả, như sau:

- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ.

B.2. Kiểm tra khả năng phân hủy Arginine

B.2.1. Môi trường Falkow

Nước pepton                            5 g

Chất chiết nấm men                   3 g

Glucoza                                    1 g

Bromocresol purple 0,2 %         10 ml

...

...

...

Hòa tan các chất và dung dịch chỉ thị màu trong nước cất. Bổ sung 0,5 % L- arginine hydrochloride. Điều chỉnh pH 6,7. Chia ra lọ nhỏ (khoảng 2 ml/ lọ). Hấp ở 115 °C trong 10 min.

B.2.2. Phản ứng và đọc kết quả

Cấy vi khuẩn (đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu ở 37 °C, 5 % CO₂ từ 18 h đến 24 h), vào môi trường trên. Kiểm tra môi trường nuôi cấy hàng ngày, trong vòng 4 ngày. Đọc kết quả như sau:

- Phản ứng dương tính (vi khuẩn phân hủy arginin): môi trường có màu tím.

- Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng

B.3. Phương pháp kiểm tra khả năng sản sinh acetoin trong môi trường Voges- Proskauer (VP)

B.3.1. Chuẩn bị môi trường, thuốc thử

Môi trường VP được pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chia ra lọ nhỏ (2,5 ml/ống), hấp vô trùng ở 120 °C trong 15 min

Thuốc thử A

...

...

...

Etanol (thuần khiết)        100 ml

Hòa tan alpha naphthol trong một lượng nhỏ etanol, đổ thêm cho đủ 100 ml. Giữ trong lọ thủy tinh có màu nâu ở nhiệt độ 4 °C.

Thuốc thử B

Kali hydroxit                              40 g

Nước cất                                  100 ml

B.3.2. Phương pháp kiểm tra và đọc kết quả

Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường VP ít nhất là 48 h ở nhiệt độ 37 °C, sau đó nhỏ thêm 0,6 ml thuốc thử A và 0,2 ml thuốc thử B. Lắc đều. Đọc kết quả sau 15 min và 1 h, như sau:

- Phản ứng dương tính: môi trường có màu hồng đậm.

- Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng hoặc không màu.

...

...

...

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

Phương pháp PCR

C.1. Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là S. suis đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu ở 37 °C, (5 % CO₂) từ 18h đến 24h.

Đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được giám định là S. suis hoặc sử dụng các chủng S. suis chuẩn.

C.2. Tách chiết DNA

Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hay bằng phương pháp shock nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: Lấy 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc hòa vào 100 ml nước vô trùng không chứa men Rnase và Dnase (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min, rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch 12000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nổi phía trên (phần nước trong) để làm phản ứng PCR.

...

...

...

Có thể sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt sau:

Gen đích

Ký hiệu mồi

Trình tự cặp mồi (5’ - 3’)

Kích cỡ sản phẩm (base pair-bp)

Chu trình nhiệt

gdh

Str2 - F (mồi xuôi)

5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’

...

...

...

Chu trình 35 vòng: (94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; 72 °C - 1 min),

72 °C - 7 min

Giữ: 4 min

Str2 - R (mồi ngược)

5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’

Phản ứng PCR

Có thể dùng các bộ kit PCR thương mại để làm phản ứng và sử dụng kết hợp theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Nếu sử dụng Taq DNA polymerase của hãng QIAGEN thì thành phần cho 1 phản ứng PCR với tổng thể tích là 50 ml gồm: 10X coral bufer: 5 ml; 200 mM mỗi loại dNTP; Taq DNA polymerase 2,5 UI; mồi xuôi và mồi ngược 1 mM mỗi loại; nước cất vô trùng; DNA tách chiết từ mẫu (C.2): 2 ml.

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn S. suis ở C.2

...

...

...

C.4. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 50 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bằng dung dịch etidi bromua 0,2 mg/100 ml.

Có thể dung các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (như SYBR safe DNA gel stain - của hãng Invitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

C.5. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

...

...

...

Các serotyp gây bệnh chủ yếu trên lợn được phát hiện thông qua các gene mã hóa quá trình sinh tổng hợp giáp mô (cps- capsular biosynthesis) tương ứng.

Có thể sử dụng các cặp mồi sau để xác định các typ huyết thanh của vi khuẩn S. suis.

Phản ứng PCR tiến hành theo B.3 và bổ sung các mẫu đối chứng dương là chủng chuẩn S. suis typ 1, 2, 1/2, 7, 9.

Một số cặp mồi cho PCR giám định týp huyết thanh

Gen đích

Sero type

Ký hiệu mồi

Chuỗi mồi (5’ - 3’)

Kích cỡ sản phẩm (bp)

...

...

...

cps 1

1

cps1H-F

cps1H-R

5’-GCGAACTGTTAGCAATGAC-3’

5’-GGCGGTCTAGCAGATGCTCG-3’

441

94 °C - 0,5 min; 60 °C - 1 min; 72 °C - 3 min: chu trình 40 vòng, 72 °C - 10 min

cps 2 và 1/2

...

...

...

cps2J-s

cps2J-as

5’-GTTGAGTCCTAATACACCTGTT-3’

5’-CAGAAAATTCATATTGTCCACC-3’

459

94 °C - 30 s; 60 °C - 30s; 72 °C - 30 s: chu trình 40 vòng, 72 °C - 7 min

cps 7

7

cps7H-F cps7H-R

...

...

...

5’-CTAATTCGATACGAAGCTAAAC-3’

541

94 °C - 0,5 min; 60 °C - 1 min; 72 °C - 3 min: chu trình 40 vòng, 72°C - 10 min

cps 9

9

cps9H-F

cps9H-R

5’-GGCTACATAATGGAAGCCC-3’

5’-GGCATCATTGCTCGACAGAT-3’

...

...

...

94 °C - 0,5 min; 60 °C - 1 min; 72°C - 3 min: chu trình 40 vòng, 72°C - 10min

cps 2

2

cps2J

cps2J

5’-TTTGTCGGGAGGGTTACTTC-3’

5’-TTTGGAAGCGATTCATCTCC-3’

498

94 °C - 1 min; 58 °C - 1 min; 72 °C -1 min 30 s: chu trình 40 vòng, 72 °C - 2 min

...

...

...

1

cps1J-F

cps1J-R

5’-TGGCTCTGTAGATGATTCTGCT-3’

 5’-TGATACGTCAAAATCCTCACC A-3’

637

94 °C - 1 min; 58 °C - 1 min; 72 °C -1 min 30 s: chu trình 40 vòng, 72 °C - 2 min

cps 7

7

...

...

...

5’-AATGCCCTCGTGGAATACAG-3’

5’-TCCTGACACCAGGACACGTA-3’

379

94 °C - 1 min; 58 °C - 1 min; 72 °C -1 min 30 s: chu trình 40 vòng, 72 °C - 2 min

cps 9

9

cps7H-F cps7H-R

5’-GGGATGATTGCTCGACAGAT-3’

5’-CCGAAGTATCTGGGCTACTGA-3’

...

...

...

94 °C - 1 min; 58 °C - 1 min; 72 °C -1 min 30 s: chu trình 40 vòng, 72 °C - 2 min

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Standard Diagnostic Manual of Diagnostic for Livestock Disease in Thailand. (2003).Third edition. National Institute Animal Health - JICA.

[2] Higgins and Gottschalk. (1999). Streptococcal Diseases. In: Disease of Swine, BE Straw, S D'Allaire, WL Mengeling and DL Taylor, Eds, lowa State University Press.

[3] Hilde E.Smith et al (1999). The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1, 2, and 9: development of rapid serotype specific PCR assays.

[4] Henk J.Wisselink, Jeroen J.Joosten, and Hilde E.Smith (2002). Multiplex PCR assay for simultaneous detection of six major serotypes and two virulence associated phenotypes of Streptococcus suis in tonsillar specimens from pigs.

[5] Silva LM, Baums CG, Rehm T, Wisselink HJ, Goethe R, Valentin-Weigand P. (2006). Virulence- associated gene profiling of Streptococcus suis isolates by PCR.Vet Microbiol. 115(1-3):117-27. Epub 2006 Jan 20.

[6] Okwumabua, O., O’Connor, M., Shull, E., (2003). A polymerase chain reaction (PCR) assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase. FEMS. Microbiol. Lett. 218, 79-84.

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-2:2010 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 1: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn