Chú thích : Dương tính: + ; Âm tính: -; Phản ứng thay đổi: (±)

Kiểm tra các đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục A.

Có thể sử dụng kit sinh hóa thương mại để định danh vi khuẩn Salmonella spp theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.2.3.2. Xác định vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

Có thể sử dụng phương pháp PCR để xác định vi khuẩn Salmonella với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt trình bày ở Bảng 2.

Bảng 2 - Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR

Gen đích

Kí hiệu

Trình tự mồi (5’-3’)

...

...

...

Chu trình nhiệt

invA

139 (mồi xuôi)

GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA

284

94 °C, 5 min;

30 chu trình:

(94 °C, 1 min; 55 °C, 1 min; 72 °C, 1 min) 72 °C trong 7 min. Giữ ở 4 °C

141 (mồi ngược)

...

...

...

Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục B.

5.2.3.3. Định typ huyết thanh

Cấy vi khuẩn đã được xác định là Salmonella bằng xác định sinh hóa hay phương pháp PCR vào môi trường thạch máu (xem 3.1), nuôi trong tủ ấm (xem 4.1). Sau từ 18h đến 24h tiến hành định typ huyết thanh.

Định typ kháng nguyên theo nhóm và kháng nguyên O bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (xem 4.4) với kháng huyết thanh chuẩn đa giá và đơn giá (xem 3.5). Các bước tiến hành phản ứng và đọc kết quả theo chỉ dẫn của nhà sản xuất kháng huyết thanh.

Định typ kháng nguyên H thường sử dụng phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm (xem 4.6). Các bước tiến hành phản ứng và đọc kết quả theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 3 - Tính kháng nguyên của một số typ huyết thanh Salmonella

Typ huyết thanh Salmonella

Nhóm

Kháng nguyên thân O

...

...

...

Pha 1 (Phase1)

(Pha 2) Phase2

S. typhimurium

B

1, 4, (5), 12

i

1,2

S. choleraesuis

C1

...

...

...

c

1,5

S. choleraesuis chủng Kunzendorf

C1

6, 7

(c)

1,5

S. typhisuis

C1

...

...

...

c

1,5

S. dublin

D1

1, 9, 12

g.p

S. heidelberg

B

...

...

...

r

1,2

S. enteritidis

D1

1, 9, 12

g,m

(1,7)

6. Kết luận

Lợn được xác định là mắc bệnh phó thương hàn khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn Salmonella trong phòng thí nghiệm thuộc các typ huyết thanh có khả năng gây bệnh cho lợn tại Bảng 3.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa

A.1. Phản ứng sinh lndol

A.1.1. Thuốc thử Kovac’s

Thành phần

Paradimetylaminobenzaldehyde 5g

Cồn amylic                                75 ml

HCl đậm đặc                             25 ml

...

...

...

Bảo quản thuốc thử trong lọ tối màu, ở 4 °C.

A.1.2. Cách tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường nước peptone (xem 3.4) hoặc môi trường nước peptone (xem 3.4) có bổ sung tryptophan, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1). Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ.

Đọc kết quả như sau:

- Phản ứng dương tính: có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường (sinh Indol).

- Phản ứng âm tính: không có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường.

A.2. Sử dụng Citrate

Pha chế môi trường (thạch simon citrate) theo quy định của nhà sản xuất. Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào thạch simon citrate, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) từ 18 h đến 24 h. Vi khuẩn sử dụng citrate (dương tính) làm môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển. Âm tính khi môi trường giữ nguyên màu xanh lá cây.

A.3. Đặc tính lên men đường glucose, lactose, sinh H₂S

...

...

...

Dùng que cấy chích sâu (xem 4.8) lấy chuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm chứa môi trường TSI hoặc Kligler, rút dần que cấy lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h kiểm tra.

Lên men đường lactoza:

- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng.

- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng.

Lên men đường glucose:

- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng.

- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng.

Khả năng sinh H₂S:

- Dương tính: Đáy ống nghiệm có màu đen.

...

...

...

A.4. Đặc tính phân hủy lysine

Sử dụng môi trường có lysine như môi trường lysine decarboxylase broth hoặc lysine- iron agar.

Sử dụng môi trường lysine- iron agar:

- Pha chế thạch nghiêng chế từ môi trường Lysine- iron agar theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường đã pha chế, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), sau từ 18 đến 24 h kiểm tra.

- Đọc kết quả: theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Sử dụng môi trường canh thang lysine decarboxylase:

- Pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường đã pha chế, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), sau từ 18 đến 24 h kiểm tra.

...

...

...

A.5. Lên men đường Manitol

Chuẩn bị môi trường

Pha nước peptone theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Chuẩn bị chỉ thị màu andrade:

- Thành phần:

Axit fucsin        0, 5 g

Nước cất          100 ml

NaOH 1N          16 ml

- Cách pha chế: Nghiền fucsin, hòa vào nước cất cho tan hết. Cho từ từ lượng NaOH 1N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 đến 17 ml). Để lắng từ 1 đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.3) ở 120 °C trong 15 min

...

...

...

Chuẩn bị đường: pha đường thành dung dịch 10% (trong nước cất vô trùng), hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.3) ở 110 °C từ 15 đến 20 min hoặc hấp cách quảng 3 lần 100 °C  trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc (xem 4.7).

Pha môi trường nước pepton-đường: cho 0,3 ml dung dịch đường 10% vào ống nghiệm chứa 4ml nước pepton đã được hấp tiệt trùng.

Cách tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào các ống môi trường nước peptone-đường, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h đọc kết quả.

Đọc kết quả:

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ.

- Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu.

PHỤ LỤC B

...

...

...

Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

B.1

Nguyên liệu PCR

B.1.1

Taq PCR Master Mix Kit (kit thương mại)

B.1.2

Cập mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2).

B.1.3

Nước tinh khiết không có nuclease

...

...

...

Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

B.1.5

Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

B.1.6

Loading dye

B.1.7

DNA chuẩn (Ladder, marker)

B.2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là Salmonella đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h.

...

...

...

B.3. Tách chiết DNA

Các vi chuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hay bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nước trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

B.4. Phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi ở Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:

- Taq PCR Master Mix Kit

12,5 μl

- Mồi xuôi 20 μM

1 μl

...

...

...

1 μl

- Nước không có nuclease

8,5 μl

- Mẫu DNA

2 μl

Tổng thể tích

25 μl

Chu trình nhiệt trong Bảng 2.

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn Salmonella (xem B.2).

...

...

...

B.5. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml.

Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).

B.6. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch.

...

...

...

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra: Không xuất hiện vạch.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] P.J.Quin, M.E.Cater, B. Markey, G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology.

[2] JICA- Third edition, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand.

[3] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy. 2012. Bệnh phó thương hàn lợn - Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc. Trang 299 - 305

...

...

...

[5] Schwartz, K.J., 1999. Salmonellosis. In: Straw, B.E., D'Allaire, S., Mengeling, W.L., Taylor, D.J. Diseases of Swine, Ames, USA: lowa State University Press, pp. 535-552

[6] Leigh A.Corner, Trevor J. Bagust, 1993. Australian Standard Diagnostic Technique for animal diseases. Standing committee agriculture and resource management.

[7] SALMONELLOSIS. Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2010.

[8] Rahn K, De Grandis SA, Clarke RC, McEwen SA, Galán JE, Ginocchio C, Curtiss R 3rd, Gyles CL. 1992. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol Cell Probes. 6(4):271-9

[9] Oliveira SD, Rodenbusch CR, Cé MC, Rocha SL, Canal CW . 2003. Evaluation of selective and non-selective enrichment PCR procedures for Salmonella detection. Lett Appl Microbiol. 36(4):217-21.

[10] Akiba M, Kusumoto M, lwata T. 2011. Rapid identification of Salmonella entericaserovars, Typhimurium, Choleraesuis, Infantis, Hadar, Enteritidis, Dublin and Gallinarum, by multiplex PCR. J Microbiol Methods. 85(1):9-15

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-19:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn