Phương pháp tiến hành, theo Phụ lục B.

5.2.3.3. Xác định vi khuẩn bằng phương pháp PCR

Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Cặp mồi đặc hiệu cho Avibacterium paragallinarum

Tên mồi

Trình tự từ đầu 5’ tới 3’

Kích thước sản phẩm

Chu trình nhiệt

N1

...

...

...

500 bp

94 °C, 10 min;

Chu trình 30 vòng:

(94 °C, 25 s;

55 °C, 50 s;

72 °C, 40 s)

72 °C trong 7 min.

Giữ ở 4 °C

R1

...

...

...

Tiến hành phản ứng PCR theo Phụ lục C.

6. Kết luận

Gà được xác định là mắc bệnh phù đầu khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn Avibacterium paragallinarum trong phòng thí nghiệm.

Phụ lục A

(Qui định)

Phương pháp nhuộm gram

A.1. Thuốc nhuộm

A.1.1. Dung dịch tím tinh thể

...

...

...

Etanol 95 %

Amoni oxalat

Nước

2,0 g

20,0 ml

0,8 g

80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2. Dung dịch fushcin gốc

...

...

...

Etanol 95 %

Phenol

Nước

1 g

10 ml

5 g

100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỷ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước.

A.1.3. Dung dịch lugol

...

...

...

Iod tinh thể

Nước

2 g

1 g

200 ml

Nghiền kali iodua và iodua tinh thể, cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Cồn 95 %

A.2. Cách tiến hành

- Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản: từ 1 min đến 2 min

...

...

...

- Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min

- Rửa nước nhanh, để khô

- Nhỏ cồn 95 %

- Rửa nước thật nhanh, để khô

- Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min

- Rửa nước

- Thấm khô hoặc sấy khô

A.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (xem 4.6).

...

...

...

Phụ lục B

(Qui định)

Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Avibacterium paragallinarum

B.1. Khả năng phân giải urê

- Sử dụng môi trường urê cơ bản (xem 3.4) (pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất) có bổ sung thêm 1% huyết thanh gà, b-NAD nồng độ cuối cùng là 5 mM và urê nồng độ cuối cùng là 20%.

- Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ thạch máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục 5.2.2 cấy vào môi trường có urê, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), đọc kết quả sau 24 h.

+ Phản ứng dương tính: Môi trường có màu hồng.

+ Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu.

B.2. Phản ứng oxidaza

...

...

...

B.3. Phản ứng catalaza

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục 5.2.2 đặt lên một điểm trên phiến kính (xem 4.4). Nhỏ một giọt dung dịch H₂O₂ 3 % lên khuẩn lạc trên phiến kính (xem 4.4). Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau vài giây. Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt.

B.4. Lên men đường

- Chuẩn bị môi trường TSB-đường:

Pha môi trường TSB (xem 3.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bổ sung 1% chỉ thị màu phenol red 0,2%, 1% NaCl (g/v). Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2, hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.2) ở 121 °C trong 15 min. Để nguội đến 45 °C, rồi bổ sung 1 % b-NAD, 1 % huyết thanh gà. Chia môi trường ra các ống nghiệm (xem 4.10), mỗi ống nghiệm khoảng 4 ml.

Chuẩn bị đường: Pha các loại đường thành dung dịch 10 %, hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.2) ở 110 °C trong từ 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc (xem 4.8).

Thêm 0,4 ml dung dịch đường 10% vào ống chứa 4 ml môi trường TSB.

- Tiến hành: Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ thạch máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục 5.2.2 cấy vào các ống môi trường TSB-đường ở phần trên, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) sau 24 h đọc kết quả.

+ Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

...

...

...

Phụ lục C

(Qui định)

Phát hiện vi khuẩn Avibacterium paragallinarum bằng phương pháp PCR

C.1. Nguyên liệu PCR

C.1.1.   Taq PCR Master Mix Kit

C.1.2. Cặp mồi (primers); mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2).

C.1.3.   Nước tinh khiết không có nuclease

C.1.4. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

...

...

...

C.1.6. Loading dye

C.1.7. DNA chuẩn (Ladder, marker)

C.2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là Avibacterium paragallinarum đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu (xem 3.1) có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus hay thạch sô-cô-la (xem 3.2) được để ở tủ ấm (xem 4.1) trong 24 h.

Đối chứng dương: Chủng vi khuẩn đã được giám định là Avibacterium paragallinarum hoặc sử dụng các chủng Avibacterium paragallinarum chuẩn.

C.3. Tách chiết DNA

Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kít thương mại hay bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 ml nước. Đun huyễn dịch trong máy ổn nhiệt khô (xem 4.11) trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá lạnh trong 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nước trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

C.4. Phản ứng PCR

...

...

...

- Taq PCR Master Mix Kit

- Mồi xuôi 20 mM

- Mồi ngược 20 mM

- Nước không có nuclease

- Mẫu DNA

Tổng thể tích

12,5 ml

1 ml

1 ml

...

...

...

2 ml

25 ml

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn Avibacterium paragallinarum (xem C.2).

Đối chứng âm: Gồm đầy đủ các thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn.

C.5. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 ml dung dịch loading dye vào 8 ml sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 ml thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml.

Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).

...

...

...

- Phản ứng dương tính khi:

+ Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

+ Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch;

+ Mẫu kiểm tra: Có vạch giống mẫu đối chứng dương.

- Phản ứng âm tính khi:

+ Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

+ Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch;

+ Mẫu kiểm tra: Không xuất hiện vạch;

...

...

...

[1]. Y.M. Saif, H.J. Barnes, J.R. Glisson, A.M. Fadly, L.R. McDouglad, D.E. Swayne, L.K. NoLan, 2008. Diseases of poultry, 789-803.

[2]. Chen, X., Miflin, J. K., Zhang, P. & Blackall, P. J. (1996). Development and application of DNA probes and PCR tests for Haemophilus paragallinarum. Avian Dis 40, 398-407.

[3]. X. Chen, Q. Chen, P. Zhang, W. Feng, P.J. Blackall. Evaluation of a PCR test for the detection of Haemophilus paragallinarum in China. Avian Pathology Volume 27, Issue 3, 1998

[4]. Chen X, Song C, Gong Y, Blackall PJ. Further studies on the use of a polymerase chain reaction test for the diagnosis of infectious coryza. Avian Pathol. 1998;27(6):618-24.

[5]. Blackall PJ. Infectious coryza: overview of the disease and new diagnostic options. Clin Microbiol Rev. 1999 Oct;12(4):627-32. Review.

[6]. P.J.Quin, M.E.Cater, B. Markey, G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology, 273-277.

[7]. D de B Welchman, S A King, P Wragg, A M Wood, R M Irvine, W J Pepper, R Dijkman, J J de Wit. Infectious coryza in chickens in Great Britain. The Veterinary record 12/2010; 167(23):912-3

[8]. Viện Thú y quốc gia - Jica, 2002. Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam, 182-183.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza)