Phương pháp tiến hành: Phụ lục C.

1.3.3.2.3 Thử độc lực trên động vật thí nghiệm

Huyễn dịch tiêm: Lấy khuẩn lạc, phân lập được từ bệnh phẩm sau khi đã được giám định hình thái, tính chất mọc trên các môi trường và sinh hoá cấy vào môi trường nước thịt, nuôi cấy tĩnh (không lắc) ở 37 oC sau 24 h lấy 0,2 ml canh trùng tiêm cho hai chuột theo dõi trong 7 ngày.

Đọc kết quả:

- Nếu tất cả 2 chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực cao.

- Nếu một nửa số chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực yếu.

- Nếu không có chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng không có độc lực.

CHÚ THÍCH: Vi khuẩn tụ huyết trùng phân lập được từ động vật thí nghiệm chết sau khi tiêm bệnh phẩm không cần kiểm tra lại độc lực trên động vật thí nghiệm.

6. Kết luận

...

...

...

- Con vật có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích của bệnh.

- Kết quả nuôi cấy, phân lập, giám định sinh hóa xác định là vi khuẩn P.multocida.  Vi khuẩn có độc lực.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

A.1 Thuốc nhuộm

A.1.1 Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C25H30N3Cl)                                                                2,0 g

...

...

...

Amoni oxalat [(NH4)2C2O4.2H2O]                                                     0,8 g

Nước                                                                                               80,0 ml

Hoà tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2 Dung dịch fuchsin basic

Fuchsin basic (C20H20ClN3)                                                          1 g

Etanol 95 %                                                                                     10 ml

Phenol (C6H6O)                                                                               5 g

Nước                                                                                               100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỉ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước.

...

...

...

Kali iodua (KI)                                                                                  2 g

Iôt (I2) tinh thể                                                                                  1 g

Nước                                                                                               200 ml

Nghiền kali iodua và iôt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Cồn axeton

Etanol 95 %                                                                           3 phần

Axeton                                                                                    1 phần

A.2. Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

...

...

...

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc sấy khô.

A.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA

B.1 Thuốc nhuộm

Giemsa dạng bột                                                                             1 g

...

...

...

Metanol nguyên chất                                                                       60 ml

Làm nóng glyxerin đến khoảng 55oC đến 60oC trong nồi đun cách thủy. Thêm thuốc nhuộm Giemsa, trộn đều và ủ trong 2 h. Sau đó, để nguội và thêm metanol giữ trong khoảng 2 tuần trước khi sử dụng. Khi sử dụng, pha loãng theo tỷ lệ 1/10 (phần thể tích) trong dung dịch đệm phosphat 0,01 M (pH 7,0) và giữ trong 30 min.

CHÚ THÍCH:   Có thể sử dụng thuốc thử Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.2 Cách tiến hành

Sau khi làm xong tiêu bản máu, cố định tiêu bản bằng metanol nguyên chất trong 10 min rồi rửa bằng nước. Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, để trong 20 min đến 30 min rồi rửa nhanh với nước và sấy khô.

B.3 Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.

PHỤ LỤC C

...

...

...

PHƯƠNG PHÁP GIÁM ĐỊNH SINH HÓA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

C.1 Giám định khả năng lên men đường glucoza, lactoza, sinh H2S, sinh hơi

C.1.1 Môi trường

Dùng thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI. Thạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactoza.

C.1.2 Tiến hành

Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy ở 37oC trong điều kiện hiếu khí 24 h.

C.1.3 Đọc kết quả

a) Lên men đường lactoza:

- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng. 
- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng.

...

...

...

- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng; 
- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng.

c) Khả năng sinh H2S:

- Dương tính: Ống nghiệm có màu đen;

- Âm tính: Ống nghiệm không có màu đen.

d) Khả năng sinh hơi:

- Dương tính: Thạch trong ống nghiệm bị nứt hay đẩy lên;

- Âm tính: Thạch trong ống nghiệm không bị nứt hay đẩy lên.

C.2 Khả năng sinh indol

C.2.1 Thuốc thử Kovac’s

...

...

...

Cồn amylic (C5H11OH)  75 ml

Axit clohydric đặc          25 ml

Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh 4oC. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml HCl, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục bổ sung HCl.

Bảo quản thuốc thử trong lọ màu, ở 4oC.

C.2.2. Cách tiến hành

Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone hoặc môi trường nước peptone có bổ sung tryptophan, nuôi cấy ở 37oC. Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ. Phản ứng dương tính khi có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường (sinh indol). Phản ứng âm tính khi không có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường.

C.3 Phân giải Urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen) (chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của nhà sản xuất).

Cấy vi khuẩn vào môi trường có urê, nuôi cấy ở 37oC, sau 24 h đọc kết quả.

...

...

...

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu tím.

C.4 Phản ứng oxidaza

Phản ứng được tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% tetra methyl P-phenyl diamine hydroclorua. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch chà sát lên trên mặt giấy. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đen tím sau 30 s. Phản ứng âm tính khi giấy tẩm giữ nguyên màu.

C.5 Phản ứng catalaza

Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch. Nhỏ một giọt dung dịch H2O23 % lên khuẩn lạc trên phiến kính. Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau vài giây. Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-14:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán - phần 14: bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò