Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch NaHCO₃ 7 %

Thành phần: NaHCO₃ 7,0 g

Nước cất 100 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút và bảo quản ở 4°C.

A.3  Dung dịch L-glutamine 3%

Thành phần: L-glutamine 3 g

...

...

...

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Sau đó, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C.

A.4  Trypsin 0,5% (10 X)

Thành phần: Trypsin 0,5g

PBS 100 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên, khuấy đều bằng cá từ và để qua đêm ở 4 °C. Sau đó, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C.

A.5  Môi trường nuôi cấy tế bào

Thành phần: MEM (Eagle’s minimum essential medium) 435 ml

L-glutamine 3% 5 ml

NaHCO₃ 7% 5 ml

...

...

...

FBS 50 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Dung dịch được bảo quản ở 4 °C.

A.6  Môi trường duy trì tế bào

Thành phần: MEM (Eagle’s minimum essential medium) 475 ml

L-glutamin 3 % 5 ml

NaHCO₃ 7 % 5 ml

Kháng sinh (Penicillin + Streptomycin) 5 ml

FBS 10 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Dung dịch được bảo quản ở 4 °C.

...

...

...

Thành phần: 89mM Tris base (FW = 121) 108 g

89 mM Boric acid (FW = 61,8) 55 g

0,5 M EDTA (pH 8,0) 40 ml

Nước cất hai lần 1000 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ phòng.

Phụ Lục B

(Quy định)

Phân lập và giám định vi rút dịch tả vịt trên phôi trứng vịt

...

...

...

a) Tiêm bệnh phẩm vào phôi trứng vịt:

- Dùng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi (không có kháng thể kháng dịch tả vịt), lấy từ trại vịt sạch bệnh.

- Soi trứng, chọn phôi khỏe. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm từ 3 phôi đến 5 phôi.

- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70%. Dùi vị trí tiêm ở phía trên buồng hơi.

- Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm đã xử lý vô trùng (bằng kháng sinh hoặc lọc qua màng lọc có kích thước 0,45 µm) rồi tiêm 0,2 ml vào xoang niệu mô.

- Gắn kín lỗ tiêm bằng keo.

- Ấp tiếp ở nhiệt độ từ 37 °C đến 38 °C. Mỗi ngày soi trứng 2 lần, loại bỏ phôi chết trước 24 giờ. Theo dõi 10 ngày sau tiêm.

- Các trứng có phôi chết hoặc gần chết được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C. Phôi nhiễm vi rút dịch tả vịt cường độc thường chết từ 3 ngày đến 8 ngày sau khi tiêm.

- Sau 10 ngày, các trứng không chết được giữ ở 4 °C để giết phôi.

...

...

...

- Mổ trứng trong điều kiện vô trùng. Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70 %.

- Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô.

- Hút nước trứng vào ống eppendorf vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 4 °C để kiểm tra.

B.2  Giám định vi rút

Dùng phương pháp trung hòa vi rút trên phôi trứng vịt.

- Pha loãng dịch niệu mô thu hoạch ở trên thành các nồng độ 10^-1 đến 10^-9 với dung dịch PBS (xem Phụ lục A).

- Lô đối chứng dương: trộn huyết thanh chuẩn kháng dịch tả vịt với dịch niệu mô đã pha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1.

- Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với dịch niệu mô đã pha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1.

- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

...

...

...

- Ấp trứng trong tủ ấm 37 °C theo dõi trong 10 ngày. Loại bỏ trứng chết trong vòng 24 giờ. Ghi chép số phôi chết.

- Nếu có vi rút dịch tả vịt lô đối chứng dương phôi sẽ sống, lô đối chứng âm phôi sẽ chết trong khoảng 3 ngày đến 8 ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.

- Dựa vào tỷ lệ sống chết của phôi để tính toán liều ELD₅₀ (hoặc EID₅₀) và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed & Muench để đánh giá kết quả.

- Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa ELD₅₀ (hoặc EID₅₀) của lô đối chứng dương tính và lô đối chứng âm tính.

- Kết quả dương tính khi NI ≥ 2.

Ví dụ: Thí nghiệm có kết quả chuẩn độ liều ELD₅₀ của vi rút dịch tả vịt như sau:

Nồng độ vi rút pha loãng

Số trứng chết/Số trứng tiêm

Phản ứng

...

...

...

Tỉ lệ chết

%

Chết

Sống

Chết

Sống

Tỷ số

10^-6

5/5

...

...

...

0

11

0

11/11

100

10^-7

4/5

4

1

...

...

...

1

6/7

86

10^-8

2/5

2

3

2

4

...

...

...

33

10^-9

0/5

0

5

0

9

0/9

0

...

...

...

ELD₅₀ = ((A-50)/(A-B)) x (b-a) + a

ELD₅₀ = [((86-50)/(86-33)) x [(-8) - (7)] + (-7) = -7,7

Như vậy, liều gây chết 50% phôi trứng là 10 ^-7,7.

Tính chỉ số trung hòa:

Vi rút pha loãng (log₁₀)

-1

-2

-3

-4

...

...

...

-6

-7

-8

- log₁₀ EID₅₀

NI

Huyết thanh (-)

...

...

...

*5/5

4/5

1/5

0/5

6,5

Huyết thanh (+)

5/5

5/5

...

...

...

2,5

4,0

Kết quả: NI = 6,5 - 2,5 = 4,0

Kết luận: bệnh phẩm dương tính vi rút dịch tả vịt.

...

...

...

Phụ Lục C

(Quy định)

Phân lập và giám định vi rút dịch tả vịt trên tế bào xơ phôi vịt

C.1  Chuẩn bị tế bào xơ phôi vịt (DEF - Duck Embryo Fibroblast)

- Chọn trứng vịt có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi, phát triển tốt. Mổ trứng, lấy phôi.

- Rửa phôi trong dung dịch PBS có chứa 1 % kháng sinh.

- Cắt bỏ đầu, chân, cánh và các cơ quan phủ tạng.

- Rửa lại phôi từ 1 lần đến 2 lần trong dung dịch PBS có chứa 1 % kháng sinh.

- Cắt nhỏ phôi.

...

...

...

- Thu hoạch tế bào đã tách bằng cách lọc qua 4 lần vải gạc, cho vào môi trường MEM (4.3.5).

- Ly tâm (5.2.3) huyễn dịch tế bào ở tốc độ 1500 g trong 5 phút ở 4 °C, loại bỏ phần nước trong.

- Rửa lại 1 lần với môi trường nuôi cấy.

- Đếm và pha loãng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10% FBS), lượng tế bào cần thiết tối thiểu 4 x 10⁵ tế bào/ml.

C.2  Phân lập vi rút dịch tả vịt trên tế bào DEF

- Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi tế bào T25 hoặc đĩa nuôi tế bào (đĩa 6 giếng, 24 giếng), sau 2 đến 3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý, thể tích nhiễm 100 µl/giếng hoặc 500 µl/lọ. Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập.

- Quan sát CPE trong các lọ nuôi cấy thời gian 7 ngày: Vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày. Nếu CPE đạt 70 % đến 80 % hoặc sau 7 ngày không có CPE thì tiến hành thu hoạch dịch tế bào.

- Cho các lọ nuôi cấy vào nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C làm đông, sau đó rã đông, lặp lại 3 lần, cuối cùng ly tâm và thu phần nước trong để giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần 2.

C.3  Giám định vi rút dịch tả vịt trên tế bào DEF

...

...

...

- Tế bào DEF đã nuôi cấy được 2 ngày đến 3 ngày trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng.

- Pha loãng vi rút phân lập: các nồng độ từ 10^-1 đến 10^-9 với môi trường MEM (4.3.5) không bổ sung FBS.

- Lô đối chứng dương tính: trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1.

- Lô đối chứng âm tính: trộn huyết thanh âm tính dịch tả vịt với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1.

b) Tiến hành

- Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đã nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 giếng), 100µ/giếng, 8 giếng/nồng độ. Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 1 giờ.

- Sau 1 giờ ủ, cho môi trường nuôi cấy MEM (4.3.5) 100 µl/giếng.

- Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm ở 37 °C, 5 % CO₂ (5.3.3) từ 7 ngày đến 9 ngày.

- Hàng ngày kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE) bằng kính hiển vi soi ngược (5.3.7), thường vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày.

...

...

...

- Dựa vào kết quả CPE của 2 lô để tính liều TCID₅₀ và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed & Muench để đánh giá kết quả.

- Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa TCID₅₀ của lô đối chứng dương tính và lô đối chứng âm tính. Kết quả dương tính khi NI ≥ 2.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

...

...

...

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF (5.2.2)

- Hút 200 µl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 µl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.3) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.4), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.4) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi DNA/RNA của kít.

...

...

...

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 µl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 µl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Phụ lục E

(Tham khảo)

...

...

...

Bảng E.1 - Trình tự mồi, đoạn dò phát hiện vi rút dịch tả vịt

STT

Tên mồi và đoạn dò

Trình tự (5’-3’)

1

Mồi xuôi DVE

CTCTACGCAGCTTTTGACGATTT

2

Mồi ngược DVE

...

...

...

3

Đoạn dò DVE

FAM -CCTCCTCCTCGCTGAGTGGCATCC-BHQ_1

Bảng E.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

STT

Thành phần nguyên liệu

Nồng độ

µM

Thể tích cho 1 phản ứng

...

...

...

1

Nước không có DNAse/RNAse

3,75

2

Mồi xuôi DVE

20

1,25

3

...

...

...

20

1,25

4

Đoạn dò DVE

5

1,25

5

Dung dịch SuperMix

...

...

...

Tổng thể tích dung dịch cho 1 phản ứng

20

6

Mẫu đã chiết tách (ADN)

5

Tổng thể tích cho 1 phản ứng

25

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime PCR

...

...

...

°C

Thời gian

Số chu kỳ

50 (*)

02 phút (*)

01

95 (*)

02 phút (*)

01

...

...

...

15 giây

45

60

45 giây

(Ghi nhận tín hiệu quang)

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kit PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.: 11730-017

Phụ lục F

(Tham khảo)

...

...

...

F.1  Trình tự mồi phát hiện ADN vi rút

Áp dụng cho kít Hot Start Taq Gold DNA polymerase (nếu dùng kít khác có thể phải thay đổi công thức thực hiện).

Bảng F.1 - Trình tự mồi xuôi và mồi ngược

STT

Tên mồi

Trình tự (5’-3’)

1

Mồi xuôi DVE

GAA-GGC-GGG-TAT-GTA-ATG-TA

...

...

...

Mồi ngược DVE

CAA-GGC-TCT-ATT-CGG-TAA-TG

Bảng F.2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần nguyên liệu

Nồng độ

µM

Thể tích cho 1 phản ứng

µl

Nước không có DNAse/RNAse

...

...

...

16,875

PCR Buffer II 10 X

2,5

MgCl₂ 25 nM

2

dNTP 10 nM

...

...

...

Mồi xuôi

10

0,5

Mồi ngược

10

0,5

Taq Gold DNA polymerase 5U

0,125

...

...

...

2,0

Tổng thể tích dung dịch cho 1 phản ứng

25,0

Bảng F.3 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Bước

Chu kỳ

Thời gian

...

...

...

°C

1

1

10 phút

95

2

35

15 giây

95

...

...

...

56

2 phút

72

3

1

7 phút

72

Giữ ở 4 °C

C.2  Chạy điện di

...

...

...

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch dung dịch nạp mẫu (loading dye) (4.2.7)).

- Sử dụng thang chuẩn AND (100 bp) (4.2.9).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

- Đọc kết quả:

+ Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương 446 bp.

...

...

...

- Đánh giá kết quả: Có vi rút dịch tả vịt trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả PCR dương tính. Nếu kết quả nghi ngờ cần lấy sản phẩm PCR giải trình tự gen.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE (Office International des Epizooties), 2012. Duck virus enteritis. Chapter 2.3.7. Terrestrial Manual.

[2] Yang F.L., Jia W.X., Yue H., Luo W., Chen X., Xie Y., Zen W. and Yang W.Q., 2005, Development of quantitative real-time polymerase chain reaction for duck enteritis virus DNA. In Avian disease. American association of avian pathologists publishing, pp 397-400.

[3] Chi cục Thú y vùng VI, 2017. Phát hiện vi rút Dịch tả vịt bằng kỹ thuật realtime PCR.

[4] Hansen W.R., Nashold S.W., Docherty D., E., Brown S.E. and Knudson D.L. (2000). Diagnosis of Duck Plague in Waterfowl by Polymerase Chain Reaction. Avian Dis., 44: 266-274

1) ^{và 2)} Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-11:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 11: Bệnh dịch tả vịt