Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên bằng cách lắc đều. Môi trường pha loãng được sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

A.2  Môi trường duy trì cho phân lập vi rút

Thành phần:

FBS

0,5 ml

TPB (29,5 g/L)

5 ml

...

...

...

0,5 ml

Glutamine (100X)

0,5 ml

Fungizone (250 ug/ml)

0,5 ml

Penicilline / Streptinomycine (10 000 Ul)

...

...

...

NaHCO₃ (7 %)

0,5 ml

EMEM / BME (1X)

42 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên bằng cách lắc đều. Môi trường duy trì được sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

A.3  Môi trường vận chuyển chứa mẫu probang

Thành phần:

...

...

...

12,5 ml

Fungizone (250 ug/ml)

20,0 ml

Penicilline / Streptinomycine (10000 Ul)

20,0 ml

MEM (1X)

...

...

...

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên bằng cách lắc đều. Môi trường vận chuyển được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

A.4  Dung dịch xử lý, bảo quản mẫu biểu mô

Thành phần:

- PBS 0,04 M

Na₂HPO₄

4,60 g/L

...

...

...

0,80 g/L

NaCl

16,00 g/l

KCl

0,80 g/L

- Kháng sinh

...

...

...

Penicilline

1000 UI/ml

Mycostatine

100 UI/ml

Neomycine

100 UI/ml

...

...

...

Polymicine

50 UI/ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần của từng dung dịch PBS 0,04 M và dung dịch kháng sinh trong 1 lít nước cất. Sau đó, kiểm tra pH từ 7,2 đến 7,6, chỉnh pH với NaOH 1 N hoặc HCl 1 N.

LƯU Ý: Khi sử dụng để bảo quản mẫu biểu mô, pha dung dịch bảo quản với Glyxerin tỷ lệ 1:1

A.5  Dung dịch đệm carbonat / bicarbonat 0,05 M, pH 9,6

Thành phần:

NaHCO₃

2,93 g/L

...

...

...

1,59 g/L

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên trong nước cất để tạo thành 1 lít dung dịch đệm carbonat/ bicarbonat.

A.6  Dung dịch PBS 0,002 M, pH 7,4

Thành phần:

Na₂HPO₄

0,23 g/L

KH₂PO₄

0,04 g/L

...

...

...

NaCl

1,6 g/L

KCl

0,04 g/L

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên trong nước cất để tạo thành 1 lít dung dịch PBS 0,002 M. Dùng cho phương pháp ELISA.

A.7  Dung dịch đệm A: PBS 0,01 M + 0,05 % Tween 20, pH từ 7,2 đến 7,6

Thành phần:

Na₂HPO₄

...

...

...

KH₂PO₄

0,20 g/L

NaCl

8,00 g/L

KCl

0,20 g/L

...

...

...

Tween 20

0,50 ml/L

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên trong nước cất để tạo thành 1 lít dung dịch đệm A. Dùng cho phương pháp ELISA.

A.8  Dung dịch đệm B: PBS 0,01 M + 0,05 % Tween 20 + 5 % sữa bột tách bơ, pH từ 7,2  đến 7,6

Thành phần:

Na₂HPO₄

1,15 g/L

KH₂PO₄

...

...

...

NaCl

8,00 g/L

KCl

0,20 g/L

Tween 20

0,50 ml/L

...

...

...

Sữa bột tách bơ

10,00g/L

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên trong nước cất để tạo thành 1 lít dung dịch đệm B. Dùng cho phương pháp ELISA.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên vi rút lở mồm long móng

B.1  Cách tiến hành

- Gắn đĩa (coating): Kháng huyết thanh thỏ kháng vi rút lở mồm long móng của các typ O, A, C và Asia 1 pha loãng 1:1000 với dung dịch đệm carbonat/ bicarboant (xem Phụ lục A), nhỏ 50 µl vào các giếng tương ứng. Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ hoặc ủ qua đêm ở 4 °C.

...

...

...

- Nhỏ 50 µl kháng nguyên đối chứng dương tính mạnh (1:10) và yếu (1:100) pha loãng bằng dung dịch đệm A (xem Phụ lục A) và mẫu bệnh phẩm vào các giếng quy định, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M.

- Nhỏ kháng thể phát hiện: Mỗi giếng nhỏ 50 µl kháng huyết thanh chuột lang kháng vi rút lở mồm long móng vào các giếng tương ứng, mỗi serotyp được pha loãng (1:100) với dung dịch đệm B (xem Phụ lục A). Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M

- Nhỏ dung dịch Conjugate (1:200 pha với dung dịch đệm B): 50 µl/giếng.

- Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37°C trong 45 phút.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M

- Nhỏ cơ chất chromogen (dung dịch chromogen + 5 % cơ chất H₂O₂ 3%): 50 µl/giếng, để 15 phút ở nhiệt độ phòng, nơi tối.

- Dừng phản ứng: nhỏ dung dịch H₂SO₄ 1,25 M với 50 µl/giếng.

...

...

...

- Đọc bằng máy đọc ELISA (5.3.1) chọn bước sóng 492 nm.

+ Nếu giá trị OD > 0,1 sau khi đã trừ đi giá trị trung bình của cột trắng thì phản ứng được coi là dương tính với serotyp đó.

+ Nếu OD = 0,1 thì cấy chuyển mẫu bệnh phẩm lên môi trường tế bào rồi kiểm tra lại.

Bảng B.1 - Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên

1

2

3

...

...

...

5

6

7

8

9

10

11

12

0

...

...

...

++

+

+

BI

BI

1

1

3

3

...

...

...

5

A

++

++

+

+

BI

BI

1

...

...

...

3

3

5

5

C

++

++

+

+

...

...

...

BI

1

1

3

3

5

5

Asia 1

++

...

...

...

+

+

BI

BI

1

1

3

3

5

...

...

...

O

++

++

+

+

BI

BI

2

2

...

...

...

4

6

6

A

++

++

+

+

BI

...

...

...

2

2

4

4

6

6

C

++

++

...

...

...

+

BI

BI

2

2

4

4

6

6

...

...

...

++

++

+

+

BI

BI

2

2

4

...

...

...

6

6

CHÚ THÍCH

++: kháng nguyên đối chứng dương tính mạnh

+: kháng nguyên đối chứng dương tính yếu

1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu xét nghiệm

...

...

...

Phụ lục C

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kít/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 (5.2.5) thì các bước được thực hiện như sau:

C.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

C.2  Tiến hành tách chiết mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 µl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 µl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và lắc trộn vortex (5.2.4).

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt các ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay chứa.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: cho vào 800 µl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ARN cho vào 100 µl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 µl dung dịch hạt từ.

...

...

...

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ARN cho vào ống thu hồi 500 µl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu tách chiết tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4 °C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime RT PCR/ RT PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime RT PCR/ RT PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80 °C.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp RT- PCR Phát hiện ARN vi rút lở mồm long móng

D.1  Trình tự mồi

...

...

...

Mồi

Chiều

Chuỗi (5’ - 3’)

Kích thước

bp

1R

Ngược

CCA GTC CCC TTC TCA GAT C

328

...

...

...

Xuôi

GCC TGG TCT TTC CAG GTC

D.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng RT-PCR

Thành phần nguyên liệu

(Theo hướng dẫn của kít QIAGEN One Step RT-PCR Kit)

Nồng độ

nM

Thể tích cho 1 phản ứng

...

...

...

Nước không có RNAse và DNAse

11,0

OneStep RT-PCR buffer 5X

5,0

dNTP Mix

10

1,0

...

...

...

10

1,0

Mồi ngược

10

1,0

Enzyme Mix

1,0

Mẫu chiết tách (ARN)

...

...

...

5,0

Tổng cộng

25

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

...

...

...

30 phút (*)

01

95 (*)

15 phút (*)

01

94

30 giây

30

55

...

...

...

72

30 giây

72

7 phút

01

Giữ ở 4 °C

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít One Step RT-PCR Kít Cat.No: 210210 (Qiagen).

D.3  Điện di sản phẩm RT-PCR

- Chuẩn bị thạch Agarose (4.10) 2 % pha trong dung dịch TBE (4.8) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (4.11)

...

...

...

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch dung dịch nạp mẫu (loading dye)).

- Sử dụng thang chuẩn ADN (100 bp) (4.9).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

- Đọc kết quả:

+ Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương (328 bp).

...

...

...

- Đánh giá kết quả: Có vi rút lở mồm long móng ở trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả PCR dương tính.

Nếu kết quả nghi ngờ cần lấy sản phẩm PCR giải trình tự gen.

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phương pháp realtime RT- PCR Phát hiện ARN vi rút lở mồm long móng

Bảng E.1 - Trình tự mồi và đoạn dò

Mồi và đoạn dò

Trình tự (5'-3’)

...

...

...

ACT GGG TTT TAC AAA CCT GTG A

Mồi ngược FMDV_Callahan 3DR

GCG AGT CCT GCC ACGGA

Đoạn dò FMDV_Callahan 3DP

FAM-TCC TTT GCA CGC CGT GGG AC-BHQ1

Mồi xuôi FMDV_SA-IR-219-246F

CAC YTY AAG RTG ACA YTG RTA CTGGTA C

Mồi ngược FMDV_SA-IR-315-293R

CAG ATY CCR AGT GWC ICI TGT TA

...

...

...

FAM-CCT CGG GGT ACC TGA AGG GCA TCC-BHQ1

Bảng E.2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

Thành phần nguyên liệu

(Theo hướng dẫn của kít Invitrogen Superscript III qRT-PCR Kít)

Nồng độ

µM

Thể tích cho 1 phản ứng

µl

Nước không có RNAse và DNAse

...

...

...

5,5

Dung dịch đệm 2X

12,5

Mồi xuôi FMDV_Callahan 3DF

20

0,5

Mồi ngược FMDV_Callahan 3DR

20

...

...

...

Đoạn dò FMDV_Callahan 3DP

6

0,5

Mồi xuôi FMDV_SA-IR-219-246F

20

1

Mồi ngược FMDV_SA-IR-315-293R

20

1

...

...

...

6

0,5

Enzyme mix

0,5

Mẫu chiết tách (ARN)

5

Tổng thể tích cho 1 phản ứng

...

...

...

25

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt phản ứng realtime RT-PCR

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

50 (*)

15 phút (*)

01

...

...

...

2 phút (*)

01

95

20 giây

40

60

40 giây

(ghi nhận tín hiệu quang)

Lưu ý: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít SuperScript ^® III Platinum ^® One step Quantitative RT-PCR system, Cat. No.: 11732-020 của hãng Invitrogen.

...

...

...

Phụ lục F

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA FMD - 3ABC

Sử dụng kít thương mại PrioCHECK™ FMDV NS Antibody ELISA Kit với Catalog number: 7610770.

F.1  Tiến hành phản ứng

Ngày 1

- Cho 80 µl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứng.

- Cho 20 µl mẫu đối chứng âm vào giếng A1 và B1.

- Cho 20 µl mẫu đối chứng dương yếu vào giếng C1 và D1.

...

...

...

- Cho 20 µl huyết thanh xét nghiệm vào các giếng theo sơ đồ xét nghiệm.

- Dán kín đĩa bằng tấm dán có sẵn trong bộ kít và lắc đều đĩa.

- Ủ qua đêm (từ 16 giờ đến 18 giờ) ở nhiệt độ 22 °C ± 3 °C.

Ngày 2

- Rửa đĩa phản ứng 6 lần với nước rửa từ 200 µl đến 300 µl/giếng.

- Cho 100 µl Conjugate đã pha loãng vào tất cả các giếng.

- Dán kín đĩa bằng tấm dán có sẵn trong bộ kít và ủ 60 phút ± 5 phút ở nhiệt độ 22 °C ± 3 °C.

- Rửa đĩa phản ứng 6 lần với nước rửa từ 200 µl đến 300 µl/giếng.

- Cho 100 µl dung dịch TMB vào tất cả các giếng, ủ 20 phút ở nhiệt độ 22 °C ± 3 °C.

...

...

...

- Đọc đĩa ở bước sóng 450 nm trên máy đọc ELISA (5.3.1).

F.2  Phân tích kết quả

1. Đo giá trị OD (optical density) ở bước sóng 450 nm trong vòng 15 phút sau khi cho dung dịch Stop.

2. Tính giá trị trung bình OD₄₅₀ ở giếng A1 và B1 (giá trị OD₄₅₀ max).

3. Giá trị PI (Percentage Inhibition) của mẫu đối chứng và mẫu huyết thanh xét nghiệm được tính bởi công thức: Pl = 100 - ((Giá trị OD₄₅₀ mẫu xét nghiệm/ giá trị OD₄₅₀ max) x 100).

F.3  Đánh giá kết quả

- Giá trị Pl trung bình của mẫu đối chứng dương yếu phải > 50 %.

- Glá trị Pl trung bình của mẫu đối chứng dương mạnh phải > 70 %.

- Giá trị trung bình OD₄₅₀ của mẫu đối chứng âm phải > 1,000.

...

...

...

- Nếu giá trị Pl của mẫu < 50 % (Pl < 50 %): mẫu không có kháng thể.

- Nếu giá trị Pl của mẫu ≥ 50 % (Pl ≥ 50 %): mẫu có kháng thể.

Phụ lục G

(Tham khảo)

Phương pháp Liquid phase blocking ELISA phát hiện kháng thể FMDV

G.1  Cách tiến hành

- Gắn đĩa ELISA: Kháng huyết thanh thỏ kháng vi rút lở mồm long móng đã pha loãng 1:1000 với dung dịch đệm carbonat/ bicarbonat (xem phụ lục A), nhỏ 50 µl/giếng. Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ hoặc ủ qua đêm (từ 16 giờ đến 18 giờ) ở nhiệt độ 22 °C ± 3 °C.

- Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên-huyết thanh, trên đĩa 96 giếng đáy chữ U:

...

...

...

+ Kháng nguyên pha loãng 1:100 với dung dịch đệm A (xem phụ lục A), 50 µl/giếng.

- Hỗn hợp được ủ qua đêm (từ 16 giờ đến 18 giờ) ở 4 °C.

- Rửa đĩa ELISA 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M (xem Phụ lục A)

- Chuyển 50 µl hỗn hợp kháng nguyên-huyết thanh từ đĩa chữ U sang đĩa ELISA theo vị trí tương ứng. Đậy nắp, ủ lắc (5.3.2) ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M (xem Phụ lục A)

- Nhỏ kháng huyết thanh chuột lang kháng vi rút lở mồm long móng pha loãng 1:100 với dung dịch đệm B (xem Phụ lục A), 50 µl/giếng. Đậy nắp, ủ lắc (5.3.2) ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M (xem Phụ lục A)

- Nhỏ conjugate: pha loãng 1:200 với dung dịch đệm B (xem Phụ lục A), 50 µl/giếng. Đậy nắp, ủ lắc (5.3.2) ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M (xem Phụ lục A)

...

...

...

- Dừng phản ứng: nhỏ 50 µl/giếng bằng dung dịch H₂SO₄ 1,25 M.

G.2  Đọc kết quả

- Đọc đĩa trên máy đọc ELISA (5.3.1), chọn bước sóng 492 nm.

- Tính Pl: Pl = 100 - ((OD mẫu /OD trung bình Ca) x 100)

+ Nếu Pl ≥ 50 thì mẫu được coi là dương tính, trong huyết thanh có kháng thể vi rút gây bệnh lở mồm long móng.

+ Nếu PI < 50 thì mẫu được coi là âm tính.

Xác định hiệu giá kháng thể, mẫu huyết thanh được pha như sau:

- Huyết thanh kiểm tra: Pha loãng theo tỷ lệ 1:8 với dung dịch đệm A (xem Phụ lục A).

- Nhỏ dung dịch dung dịch đệm A: 50 µl/giếng vào các lỗ của đĩa chữ U bắt đầu từ cột 3 cho đến cột thứ 12 của tất cả các hàng.

...

...

...

- Huyết thanh đối chứng: Chuẩn bị giống phát hiện kháng thể

- Nhỏ kháng nguyên đã pha loãng theo tỷ lệ cho trước 50 µl/giếng.

- Hỗn hợp kháng nguyên - huyết thanh được ủ qua đêm ở 4 °C.

- Các bước sau tiến hành theo trình tự giống phản ứng ELISA phát hiện kháng thể.

- Nếu tất cả giá trị Pl trong 2 giếng của mẫu huyết thanh xét nghiệm nhỏ hơn 50 (Pl<50) thì mẫu này được xem là không có kháng thể (mẫu âm tính).

- Nếu có một trong 2 giếng đó có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl >50) ở độ pha loãng 1/32 nhưng tất cả các giá trị Pl ở độ pha loãng kế tiếp có Pl<50 thì mẫu xét nghiệm này có hiệu giá kháng thể là 1/32 .

- Nếu cả hai giếng có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl >50) ở độ pha loãng 1/32 và tất cả các giá trị Pl ở độ pha loãng kế tiếp có Pl<50 thì mẫu này có hiệu giá kháng thể là 1/45 và mẫu xét nghiệm này được xem là mẫu có kháng thể (mẫu dương tính).

- Hiệu giá kháng thể của các mẫu xét nghiệm có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl>50) ở độ pha loãng 1/32 có thể tham khảo ở bảng G.3. Nếu hiệu giá kháng thể lớn hơn 90 (>90) cho biết rằng con vật này có khả năng bảo hộ với serotype vi rút lở mồm long móng tương đồng với kháng nguyên sử dụng trong phản ứng.

Bảng G.1 - Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng thể

...

...

...

1

2

3

4

5

6

7

8

9

...

...

...

11

12

A

C⁺⁺

C⁺⁺

1

1

9

9

...

...

...

17

25

25

33

33

B

C⁺⁺

C⁺⁺

2

...

...

...

10

10

18

18

26

26

34

34

C

...

...

...

C⁺

3

3

11

11

19

19

27

27

...

...

...

35

D

C⁺

C⁺

4

4

12

12

20

...

...

...

28

28

36

36

E

C^-

C^-

5

5

...

...

...

13

21

21

29

29

37

37

F

C^-

...

...

...

6

6

14

14

22

22

30

30

38

...

...

...

G

Ca

Ca

7

7

15

15

23

23

...

...

...

31

39

39

H

Ca

Ca

8

8

16

...

...

...

24

24

32

32

40

40

Bảng G.2 - Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA xác định hiệu giá kháng thể

1

...

...

...

3

4

5

6

7

8

9

10

11

...

...

...

A

C⁺⁺

C⁺⁺

1

1

3

3

5

5

...

...

...

7

9

9

B

C⁺⁺

C⁺⁺

1

1

3

...

...

...

5

5

7

7

9

9

C

C⁺

C⁺

...

...

...

1

3

3

5

5

7

7

9

9

...

...

...

C⁺

C⁺

1

1

3

3

5

5

7

...

...

...

9

9

E

C^-

C^-

2

2

4

4

...

...

...

6

8

8

10

10

F

C^-

C^-

2

...

...

...

4

4

6

6

8

8

10

10

G

...

...

...

Ca

2

2

4

4

6

6

8

8

...

...

...

10

H

Ca

Ca

2

2

4

4

6

...

...

...

8

8

10

10

CHÚ THÍCH C⁺⁺: huyết thanh đối chứng dương tính mạnh

C⁺: huyết thanh đối chứng dương tính yếu

C^-: huyết thanh đối chứng âm tính

Ca: đối chứng kháng nguyên

1 đến 40: mẫu

...

...

...

Huyết thanh pha loãng

Mẫu huyết thanh với những giá trị Pl khác nhau >50%

1

2

3

4

5

6

7

...

...

...

32

+-

++

++

++

++

++

++

++

...

...

...

--

--

+-

++

++

++

++

++

128

...

...

...

--

--

--

+-

++

++

++

256

--

...

...

...

--

--

--

--

+-

++

Hiệu giá kháng thể

32

45

...

...

...

90

128

181

256

>256

Phụ lục H

(Tham khảo)

Phương pháp trung hòa vi rút trên tế bào động vật (VNT)

...

...

...

Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng với 100TCID₅₀/ 50 µl.

H.1  Thực hiện trên đĩa phản ứng: Huyết thanh pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512.

- Mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.

- Cho 50 µl dung dịch vi rút với 100 TCID₅₀ /50 µl vào các giếng.

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 60 phút

- Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK 21 (10⁶ tế bào/ml trong môi trường chứa 10 % FBS) vào tất cả các giếng

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 48 giờ.

Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược (5.4.4) để ghi nhận bệnh tích tế bào.

H.2  Thực hiện trên đĩa đối chứng

...

...

...

+ Mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.

+ Cho 50 µl dung dịch vi rút với 100TCID₅₀ / 50 µl vào các giếng.

+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 60 phút

+ Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK 21 (10⁶ tế bào/ml) vào tất cả các giếng

+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 48 giờ

- Đối chứng tế bào

+ Cho 100 µl môi trường vào giếng A6 đến D6 và A7 đến D7.

+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 60 phút

- Đối chứng môi trường

...

...

...

+ Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 60 phút

H.3  Chuẩn độ lại vi rút sử dụng

- Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng: từ 10^-1 đến 10^-4

- Cho 50 µl môi trường vào các giếng từ A9 đến H12.

- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10^-1 và các giếng từ A9 đến H9.

- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10^-2 và các giếng từ A10 đến H10.

- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10^-3 và các giếng từ A11 đến H11.

- Cho 50 µl vi rút pha loãng 10^-4 và các giếng từ A12 đến H12.

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 60 phút

...

...

...

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 60 phút

- Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược (5.4.4) để ghi nhận bệnh tích tế bào.

H.4  Kết quả

Tính hiệu giá kháng thể trung hòa của mẫu huyết thanh dựa vào công thức Karber (1931).

Hiệu giá trung hòa 50% = a + 0,5 - 1/n x Σrl

Với: a: độ pha loãng huyết thanh cao nhất có ít nhất một giếng không có bệnh tích tế bào (lấy giá trị số mũ).

Σrl: tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong các độ pha loãng có ít nhất một giếng không có bệnh tích tế bào.

n: số giếng sử dụng cho một độ pha loãng

H.5  Điều kiện để chấp nhận kết quả

...

...

...

- Hiệu giá của mẫu đối chứng huyết thanh dương chuẩn chỉ chênh lệch ± 1 độ pha loãng bậc 2 so với hiệu giá đã biết (log₁₀ độ pha loãng bậc 2 của hiệu giá đã biết ± 0,3)

- Hiệu giá chuẩn độ lại của vi rút nằm trong khoảng log₁₀ hiệu giá vi rút đã biết ± 0,5.

H.6  Kết luận

- Mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa 50 % ≥ 1,65 (1/45) được xem là mẫu dương tính.

- Mẫu không có hiệu kháng thể trung hòa 50 % ≤ 1,2 (1/16) được xem là mẫu âm tính.

- Mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa từ 50 % từ 1,2(1/16) đến 1,65 (1/45) được xem là mẫu nghi ngờ. Nếu mẫu kiểm tra lại lần 2 có hiệu giá > 1,2 (1/16) được xem là mẫu dương tính.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE (Office International des Epizooties), 2017. Foot and mouth Disease. Chapter 3.1.8. Terrestrial Manual.

...

...

...

1) ^{và 2)} Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 1: Bệnh lở mồm long móng