Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8379:2010 về tôm và sản phẩm tôm – Phát hiện virut gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

Tải văn bản

Thuộc tính
Nội dung
Tiếng anh
Lược đồ

Mồi	Trình tự	Sản phẩm
309F	5’-TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-A-3’	309 bp
309R	5’-TGT-CTG-CTA-CGA-TGA-TTA-TCC-A-3’	309 bp
MG831F	5’-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3’	831 bp
MG831R	5’-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3’	831 bp

Nồng độ của mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 25 mM trong dung dịch đệm TE. Dung dịch đệm TE chứa Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) và EDTA 1 mM.

5.2 Các thuốc thử tách chiết DNA

5.2.1 Dung dịch đệm ly trích

5.2.1.1 Thành phần

Thuốc thử

Khối lượng

Nồng độ cuối

Tris (hydroxymetyl)-aminometan

6,06 g

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Etylendiaminetetra axetic axit (EDTA)

0,37 g

1 mM

Natri clorua (NaCl)

29,22 g

500 mM

Natri dodexyl sulfat (SDS)

10,0 g

1 %

...

10 µg/ml

Nước vừa đủ

1000 ml

pH 8,0

5.2.1.2 Chuẩn bị

Sử dụng nước cất hai lần vô trùng ít hơn thể tích cuối cùng để hòa tan Tris, EDTA và NaCl, khuấy và đảo đều dung dịch. Ở pH thấp, EDTA sẽ tan dễ dàng. Sử dụng HCl để chỉnh pH dung dịch về giá trị 8,0. Cuối cùng thêm lượng SDS cần thiết vào dung dịch và thêm nước cho đủ thể tích cuối. Nên hấp khử trùng dung dịch này để bất hoạt DNA nhiễm vào và giữ được dung dịch đệm lâu hơn.

CHÚ THÍCH 1 Trước khi sử dụng dung dịch đệm ly trích nên bổ sung thêm proteinaza K với nồng độ như trên. Ví dụ: thêm 50 ml dung dịch Proteinaza K nồng độ gốc 20mg/ml vào mỗi 10ml dung dịch đệm ly trích.

...

Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong trường hợp sử dụng thuốc thử và vật liệu riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành phần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho sinh học phân tử.

CHÚ THÍCH 3 Có nhiều quy trình dùng để tách chiết axit nucleic (DNA) từ mô động vật. Đối với mô tôm, việc tách chiết DNA là không quá khó, vì vậy trong quy trình trên đề cập đến phương pháp tách chiết bằng dung dịch đệm ly trích là phương pháp đơn giản, dễ thực hiên. Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào việc sử dụng sản phẩm PCR vào mục đích tạo dòng, lai… nên chọn các phương pháp thích hợp và tối ưu hơn, ví dụ như phương pháp dùng hệ thống cột ly tâm để tách chiết DNA hoặc sử dụng các bộ chế phẩm tách chiết thương mại có bán sẵn.

5.2.2 Tách chiết DNA dùng hệ thống cột ly tâm

5.2.2.1 Dung dịch đệm ly giải mô

urê 4M, Tris 200 mM, NaCl 20 mM, EDTA 200 mM, có pH 7,4. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.2.2.2 Dung dịch đệm liên kết

Guanidin-HCl 6M, urê 10 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 20 % (phần thể tích), có pH 4,4. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.2.2.3 Proteinaza K.

5.2.2.4 Dung dịch đệm loại bỏ chất ức chế

...

5.2.2.5 Dung dịch đệm rửa

Thêm vào 80 ml etanol tinh khiết NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, có pH 7,5.

5.2.2.6 Dung dịch đệm rửa giải

Tris-HCl 10 mM, có pH 8,5. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.3 Pha chế dung dịch đệm TE (dùng để pha loãng cặn DNA)

Hòa tan Tris 10 mM với EDTA 1 mM, chỉnh pH về giá trị 7,6 bằng dung dịch HCl.

5.4 Hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (Master mix)

5.4.1 Thành phần

Thuốc thử

...

Nồng độ cuối

Nước cất hai lần

16,0 ml

Dung dịch đệm đậm đặc 10 lần

2,5 ml

Đậm đặc 1 lần

dNTP

0,5 ml cho mỗi loại

...

Hỗn hợp mồi A

0,5 ml

0,31 mM

Hỗn hợp mồi B

0,5 ml

0,31 mM

MgCl₂

2,0 ml

2 mM

...

0,5 ml

2,5 U

CHÚ THÍCH Hỗn hợp mồi A, B tương ứng với các trình tự 309 F/R, MG831 F/R.

5.4.2 Có thể sử dụng hỗn hợp phản ứng PCR như PCR - hạt, thành phần gồm chất ổn định: BSA, dNTP, khoảng 2,5 đơn vị Taq DNA polymeraza và dung dịch đệm phản ứng. Trước khi sử dụng hạt, cần hoàn nguyên đến thể tích cuối 25 µl, nồng độ mỗi dNTP là 200 µM trong Tris-HCl 10 mM, có pH 9,0 ở nhiệt độ phòng, KCl 50 mM và MgCl₂1,5 mM.Nên sử dụng hỗn hợp phản ứng PCR được bán sẵn trên thị trường.

5.5 Thang DNA

Sử dụng thang đo phù hợp để ước lượng được đoạn khuếch đại 309 bp và 831 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 309 bp và 831 bp đã biết trước.

5.6 Pha chế một số hoá chất điện di

5.6.1 Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA đậm đặc 10 lần)

Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Sau đó, thêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 ^oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng mới pha loãng với nước cất vô trùng thành dung dịch đậm đặc 0,5 lần.

...

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước rồi chỉnh cho dung dịch có pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 4 N. Sau đó, thêm nước cất cho đủ 500 ml. Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.6.3 Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần

Hoà tan các thành phần: Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM.

5.6.4 Dung dịch dietypyrocarbonat (DEPC)

Trộn 0,1 % (phần thể tích) dietypyrocarbonat vào nước cất, lắc khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 ^oC trong 15 min.

5.6.5 Tạo bảng thạch 1,5 % (Gel agaroza 1,5 %)

5.6.5.1 Tạo bảng thạch 1,5 %

Đun tan hoàn toàn 1,5 g agaroza trong 100 ml dung dịch đệm TBE đậm đặc 0,5 lần. Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 10 min (đạt 55 °C đến 60 °C).

5.6.5.2 Dung dịch etidi bromua, nồng độ 10 mg/ml

...

Chuyển agaroza vừa đun vào một chai chuyên dùng để pha etidi bromua, sau đó cho vào 4ml etidi bromua 10 mg/ml (cho 4 ml etidi bromua 10 mg/ml vào 100 ml dung dịch agaroza), trộn đều (tránh tạo bọt khí). Chuẩn bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt nước, gắn lược vào khuôn, sau đó đổ agaroza vào khuôn đạt độ dày khoảng 3 mm đến 5 mm. Để đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Gỡ lược, đặt bảng thạch vào trong máng điện di, các giếng của bảng thạch phải ở phía gần điện cực âm. Đổ dung dịch TBE đậm đặc 0,5 lần cho đến khi ngập bảng thạch trước khi cho mẫu vào để điện di.

5.6.5.4 Nhuộm ngoài

Sau khi điện di, ngâm bảng thạch vào dung dịch etidi bromua 10 mg/ml (5 µl hoà tan trong 100 ml nước cất). Dung dịch này phải bao phủ toàn bộ bảng thạch. Lắc nhẹ trong khoảng 20 min. Sau đó, vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa với nước cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề mặt bảng thạch.

6 Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

6.1 Bộ nghiền mẫu vô trùng.

6.2 Máy ly tâm, có thể hoạt động với tốc độ tối đa trên 12 000 r/min.

6.3 Máy luân nhiệt.

6.4 Bộ điện di, gồm nguồn và buồng điện di.

...

6.6 Micropipet, dung tích 10 µl; 20 µl; 100 µl; 1000 µl.

6.7 Ống nghiệm đáy côn (ống Eppendorf), dung tích 1,5 ml và 0,2 ml.

6.8 Ðầu típ các loại, có đầu lọc với thể tích không lớn hơn 10 µl.

6.9 Khuôn, khay, lược dùng để tạo bảng thạch.

6.10 Ống lọc tinh, có 2 lớp màng lọc, có thể chứa 700 µl dịch mẫu.

6.11 Ống góp, dùng bọc ngoài ống lọc tinh.

7. Cách tiến hành

7.1 Chuẩn bị mẫu

7.1.1 Đối với mẫu tôm hậu ấu trùng: lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ 10 đến 30 nguyên con. Đối với tôm hậu ấu trùng 11 ngày tuổi trở lên loại bỏ đầu.

...

7.1.3 Đối với mẫu tôm thương phẩm: lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg phiến mang tôm, chân bơi, chân bò, cơ hoặc khoảng 100 µl dịch bạch huyết của tôm.

7.1.4 Yêu cầu đối với mẫu để phân tích: mẫu tôm còn sống và bảo quản trong cồn 95 % ngay sau khi lấy. Thể tích cồn sử dụng để bảo quản không nên nhỏ hơn 3 lần thể tích mẫu cần phân tích. Sau khi cố định, mẫu được lưu giữ ở nhiệt độ khoảng từ 25 ^oC đến 30 ^oC trong 1 tuần lễ. Khi cần bảo quản mẫu lâu hơn nữa phải thay cồn mới.

7.2 Tách chiết DNA

Có thể sử dụng một trong hai phương pháp tách chiết DNA sau:

7.2.1 Sử dụng dung dịch đệm ly trích (5.2.1)

7.2.1.1 Cho khoảng 100 mg đến 200 mg mẫu tôm (7.1) cho vào ống nghiệm đáy côn có thể tích 1,5 ml, bổ sung 500 µl dung dịch đệm ly trích (5.2.1), nghiền nhuyễn mẫu.

7.2.1.2 Ủ mẫu ở 95 ^oC trong 10 min.

7.2.1.3 Ly tâm với tốc độ 12 000 r/min trong 10 min.

7.2.1.4 Chuyển 200 µl dịch nổi phía trên vào ống ống nghiệm đáy côn 1,5 ml sạch.

...

7.2.1.6 Trộn nhanh bằng máy trộn rung (vortex), ly tâm với tốc độ 12 000 r/min trong 5 min.

7.2.1.7 Gạn bỏ dung dịch etanol, giữ lại cặn.

7.2.1.8 Làm khô cặn DNA ở nhiệt độ phòng.

7.2.1.9 Hoà tan phần cặn trên với dung dịch DEPC (5.6.4) hoặc dung dịch đệm TE (5.3).

7.2.2 Sử dụng hệ thống cột ly tâm (5.2.2)

7.2.2.1 Cho khoảng 100 mg đến 200 mg mẫu tôm (7.1) vào ống nghiệm đáy côn 1,5 ml, bổ sung 200 µl dung dịch đệm ly giải mô, nghiền mẫu với chày nghiền vô trùng.

7.2.2.2 Tiếp tục thêm 50 µl enzym proteinaza K, trộn đều dung dịch, ủ các ống nghiệm đáy côn ở 55 ^oC trong 1 h.

7.2.2.3 Thêm 200 µl dung dịch đệm liên kết, trộn đều ngay và đem ủ ở 70 ^oC trong 10 min.

7.2.2.4 Làm ấm lọ có dung dịch đệm rửa giải ở 70 ^oC.

...

7.2.2.6 Chuyển phần dịch nổi sang các ống nghiệm đáy côn 1,5 ml mới chứa sẵn 100 µl isopropanol. Trộn đều và chuyển toàn bộ dung dịch sang các ống lọc tinh có gắn ống góp.

7.2.2.7 Ly tâm các ống với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.

7.2.2.8 Thêm 500 µl dung dịch loại bỏ chất ức chế vào các lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng góp mới.

7.2.2.9 Thêm 500 µl dung dịch đệm rửa vào các lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng góp mới.

7.2.2.10 Lặp lại bước 7.2.2.8 và 7.2.2.9.

7.2.2.11 Ly tâm các ống góp chứa ống lọc tinh trong 20 s ở tốc độ cao nhất có thể để loại bỏ hoàn toàn dung dịch đệm rửa.

7.2.2.12 Chuyển các ống lọc tinh sang các ống nghiệm đáy côn 1,5 ml. Thêm 100 µl dung dịch đệm rửa giải có nhiệt độ 70 ^oC, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Loại bỏ phần ống lọc tinh. Thu được dung dịch DNA ở các ống nghiệm đáy côn.

CHÚ THÍCH Do nguồn mẫu khác nhau có hàm lượng DNA không giống nhau, vì vậy cần điều chỉnh nồng độ DNA bằng cách hoà tan DNA vào các thể tích dung dịch DEPC hoặc dung dịch TE phù hợp theo lượng DNA thu được. Việc xác định hàm lượng DNA có thể tiến hành bằng cách đo giá trị mật độ quang (OD) của dịch pha loãng theo tỉ lệ 1:5 (10 µl dịch DNA thu được: 40 µl nước) ở bước sóng 260 nm (OD₂₆₀) hoặc bằng cách điện di 10 µl dịch DNA thu được ở nồng độ thạch 1,5 %.

Nếu các mẫu phải bảo quản trong thời gian dài, nên sử dụng dung dịch đệm TE để hoà tan cặn DNA và bảo quản ở –20 ^oC. Sử dụng ngay dịch này cần phải bảo quản ở 2 ^oC đến 8 ^oC.

...

Để đảm bảo kết quả phân tích có độ tin cậy cao nên quá trình khuếch đại cần chuẩn bị đầy đủ các yếu tố sau:

a) DNA của mẫu đã biết trước không có virut IHHNV;

b) DNA của mẫu đã biết trước dương tính IHHNV (bao gồm mẫu mô, máu hoặc plasmid); DNA mẫu trắng (nước cất hai lần).

7.3.1 Mẫu

1 µl dịch chiết DNA cho vào ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

7.3.2 Mẫu kiểm chứng dương tính

1 µl mẫu kiểm chứng dương tính cho vào một chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

7.3.3 Mẫu kiểm chứng âm tính

1 µl mẫu kiểm chứng âm tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

...

Sau khi cho dịch tách chiết mẫu, mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính vào ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR đã được đánh dấu, đậy nắp ống thật chặt, ly tâm nhẹ để dung dịch tụ hết xuống đáy ống không còn dính trên thành ống. Đặt các ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR vào máy luân nhiệt thực hiện phản ứng theo chương trình sau:

Số chu kỳ

Nhiệt độ, ^oC

Thời gian

5 min

...

30 s

1 min

5 min

Giữ ở 4 ^oC cho đến khi phân tích.

7.4 Điện di

...

7.4.2 Hút khoảng 5 ml đến 7 ml từ các ống (7.4.1): mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu kiểm chứng dương tính, thang DNA chuẩn, các mẫu vào mỗi giếng trên bảng thạch. Trình tự hút mẫu cho vào giếng: mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu thử, mẫu kiểm chứng dương tính, thang DNA chuẩn.

7.4.3 Điện di ở hiệu điện thế 100 V đến 120 V. Sau khi nối điện, quan sát bong bóng khí từ hai phía của điện cực.

CHÚ THÍCH Dung dịch đệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm là chỉ thị bromphenol blue; màu xanh nhạt là chỉ thị xylen cyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng gel agaroza, dừng quá trình điện di.

Để đảm bảo kết quả phân tích có độ tin cậy cao, cần tiến hành điện di mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu kiểm chứng dương tính, thang DNA chuẩn, mẫu phân tích.

7.4.4 Nhuộm etidi bromua bảng thạch (chỉ áp dụng cho nhuộm ngoài)

Xem 5.6.5.4.

7.5 Đọc kết quả

7.5.1 Đọc kết quả

7.5.1.1 Đọc kết quả bằng mắt thường: đặt bảng gel vào máy đọc UV đã được lắp kính chắn. Bật đèn UV. Dưới ánh sáng của tia UV, các đoạn DNA có etidi bromua chèn giữa 2 mạch sẽ phát quang tạo thành vạch sáng.

...

7.5.2 Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính và thang DNA để đưa ra kết luận.

7.5.3 Cách đọc kết quả

Đọc kết quả điện di theo trình tự như sau:

Kết quả điện di

Giếng

Vạch 831 bp

Vạch 309 bp

Kết quả

Thang DNA

...

Điện di tốt

Mẫu kiểm chứng dương tính [+]

Có

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

Có

Chấp nhận được

Không

...

Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng, enzym hỏng

Có

Không

Không chấp nhận kết quả

Mẫu kiểm chứng âm tính [-]

Không

Không ngoại nhiễm

Có

...

Bị ngoại nhiễm

Có

không

Không

Có

Mẫu thử

Có

Có IHHNV và có đoạn DNA của tôm tương đồng với DNA của IHHNV

...

Có

Có IHHNV

Không

Không có IHHNV

Có

Không

Không có IHHNV, có đoạn DNA của tôm tương đồng với DNA của IHHNV

8. Diễn giải kết quả

...

8.1 Kết quả âm tính

Kết quả được coi là âm tính khi:

– phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

– không phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

– thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

– mẫu phân tích không có vạch DNA đích.

8.2 Kết quả dương tính

Kết quả được coi là dương tính khi:

– phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

...

– thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

– mẫu phân tích xuất hiện vạch DNA đích.

8.3 Kết quả nghi ngờ

Khi thử nghiệm cho kết quả nghi ngờ (không phát hiện vạch sáng ở mẫu kiểm chứng dương tính, phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính hoặc thang DNA không phân vạch rõ ràng...), thì phải tiến hành phân tích lại.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu có);

– phương pháp thử sử dụng;

...

– kết quả thử nghiệm thu được;

– báo cáo kết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi phòng thử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.

Nội dung văn bản đang được cập nhật

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8379:2010 về tôm và sản phẩm tôm – Phát hiện virut gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

Số hiệu:	TCVN8379:2010
Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***
Người ký:	***
Ngày ban hành:	01/01/2010
Ngày hiệu lực:	Đã biết
Tình trạng:	Đã biết

Văn bản được hướng dẫn - [0]

Văn bản được hợp nhất - [0]

Văn bản bị sửa đổi bổ sung - [0]

Văn bản bị đính chính - [0]

Văn bản bị thay thế - [0]

Văn bản được dẫn chiếu - [0]

Văn bản được căn cứ - [0]

Văn bản liên quan ngôn ngữ - [0]

Văn bản đang xem

Văn bản liên quan cùng nội dung - [4]

Văn bản hướng dẫn - [0]

Văn bản hợp nhất - [0]

Văn bản sửa đổi bổ sung - [0]

Văn bản đính chính - [0]

Văn bản thay thế - [1]

- 14 +

Tải Văn bản tiếng Việt

Chưa có Video

Hãy đăng nhập hoặc đăng ký Tài khoản để biết được tình trạng hiệu lực, tình trạng đã bị sửa đổi, bổ sung, thay thế, đính chính hay đã được hướng dẫn chưa của văn bản và thêm nhiều tiện ích khác