TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14115:2024

PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI KALI BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

Fertilizers -  Enumeration of microorganisms potassium resolution by colony-count method

Lời nói đầu

TCVN 14115:2024 do Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI KALI BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

Fertilizers - Enumeration of microorganisms potassium resolution by colony-count method

...

...

...

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi sinh vật phân giải kali bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Tiêu chuẩn áp dụng cho các loại phân bón, nguyên liệu sản xuất phân bón có chứa vi sinh vật phân giải kali.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4884: 2005 (ISO 4833:2003) Thực phẩm, thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung và thức ăn chăn nuôi. Định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 °C.

TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014) Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 12105:2018 Phân bón vi sinh vật - Lấy mẫu

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau đây:

...

...

...

Môi trường chọn lọc vi sinh vật phân giải kali (Selective medium for potassium solubilizing microorganisms )

Môi trường dinh dưỡng đặc biệt Aleksandrov, ở đó vi sinh vật có khả năng phân giải kali tạo được vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc.

3.2

Vi sinh vật phân giải kali (Potassium-solubilizing microorganisms)

Vi sinh vật phân giải kali rất đa dạng (bao gồm cả vi khuẩn và nấm) có khả năng giải phóng kali từ các khoáng chất chứa kali.

3.3

Phát hiện vi sinh vật phân giải kali (Detection of Potassium-solubilizing microorganisms)

Phát hiện vi sinh vật phân giải kali trong phân bón, nguyên liệu sản xuất phân bón dựa trên vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch Aleksandrov.

3.4

...

...

...

Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật phân giải kali (CFU/g hoặc CFU/ml) trong một đơn vị khối lượng hoặc thể tích cụ thể của phân bón, nguyên liệu sản xuất phân bón khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

4  Nguyên tắc

Phát hiện vi sinh vật phân giải kali trong phân bón, nguyên liệu sản xuất phân bón dựa trên vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch Aleksandrov và định lượng vi sinh vật phân giải kali bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường này.

5  Thiết bị, dụng cụ

Có thể sử dụng các dụng cụ dùng một lần thay cho các dụng cụ sử dụng nhiều lần nếu các thông số kỹ thuật tương tự.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ dùng trong thử nghiệm vi sinh thông thường được quy định trong TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007) và cụ thể như sau:

5.1  Thiết bị

5.1.1  Tủ cấy vi sinh vật, đảm bảo độ vô trùng.

5.1.2  Nồi hấp áp lực, có nhiệt độ hơi nước bão hòa trong buồng có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 °C ± 3 °C tương ứng áp suất tối thiểu 101,3 kPa.

...

...

...

5.1.4  Tủ ấm, thông gió đối lưu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 35 °C, độ chính xác đến 1 °C.

5.1.5  Máy lắc, tốc độ đạt 200 r/min.

5.1.6  Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,001 g.

5.1.7  Máy trộn Vortex, tốc độ lắc đạt 1 000 r/min, lắc tròn.

5.1.8  Kính hiển vi quang học, có độ phóng đại đến 1 000X, sử dụng vật kính soi dầu.

5.1.9  Máy đo pH, có độ chính xác đến ±0,1 đơn vị pH ở 25 °C.

5.1.10  Bể ổn nhiệt, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 90 °C

5.1.11  Máy khuấy từ gia nhiệt, có tốc độ khuấy từ 0 đến 1500 r/min và có nhiệt độ dao động 0-100 °C

5.1.12  Máy chụp ảnh thông thường

...

...

...

5.2  Dụng cụ

5.2.1  Bình tam giác, thủy tinh có dung tích 250 ml, 500 ml.

5.2.2  Cốc thủy tinh, có dung tích 100 ml, 250ml.

5.2.3  Ống nghiệm, có dung tích 16 x 160 mm.

5.2.4  Que cấy vòng, đầu que cấy bằng chất liệu Volfram.

5.2.5  Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo hoặc bằng thép.

5.2.6  Pipets, có dung tích danh định 10 ml, 1 ml, 0,1 ml, 0,01 ml; sử dụng đầu tip vô trùng.

5.2.7  Đĩa Petri, đường kính 90 mm.

6  Môi trường, hóa chất

...

...

...

Sử dụng các loại hóa chất phân tích tinh khiết. Chuẩn bị và khử trùng môi trường nuôi cấy theo TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014).

Ưu tiên sử dụng các thành phần cơ bản dạng khô, hoặc các môi trường hoàn chỉnh dạng khô để chuẩn bị môi trường nuôi cấy; thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Nước sử dụng phải là nước cất vô trùng hoặc có chất lượng tương đương quy định trong TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007).

6.2  Môi trường Aleksandrov

6.2.1  Thành phần

Tinh bột tan (C₆H₁₀O₅)n                                                     20,0 g

Magie sunphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO₄.7 H₂O)    0,5g

Sắt III clorua (FeCl₃)                                                         0,005 g

Canxi carbonat (CaCO₃)                                                   0,1 g

...

...

...

Leucite (KAISi₃O₆)                                                            5g

Agar                                                                               20g

Nước cất (H₂O) bổ sung đạt thể tích                                 1000 ml

pH                                                                                  7.0 ±0,2

6.2.2  Chuẩn bị

Cân và hòa tan các thành phần trong nước cất theo thứ tự đã liệt kê (6.2.1), đun nóng nếu cần. Điều chỉnh pH về 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng bằng dung dịch HCl 1M (36,45 g HCl trong 1 L nước cất) và NaOH 3 M (120 g NaOH trong 1 L nước cất). Phân phối hỗn hợp với lượng thích hợp vào các bình thủy tinh (5.2.1). Không vặn chặt nắp bình thủy tinh. Khử trùng 15 min, trong nồi hấp áp lực (5.1.2) ở 121 °C.

Sau khi khử trùng, làm nguội đến 45 °C - 50 °C. Phân phối lượng khoảng từ 18 mL đến 20 mL môi trường Aleksandrov vào các đĩa Petri (5.2.7) đã được chuẩn bị như nêu tại 8.1.1 và để cho đông đặc. Các thao tác tiến hành trong tù cấy vô trùng (5.1.1);

Khi bề mặt môi trường đã khô, kiểm tra độ vô trùng bằng cách lật úp các đĩa thạch và để trong tủ ấm (5.1.4) ở nhiệt độ 29 °C ± 1 °C trong 16 h hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Các đĩa môi trường sau đó được sử dụng ngay hoặc bảo quản 4 °C trong vòng 1 tuần.

6.3  Chuẩn bị dung dịch pha loãng

...

...

...

Natri clorua (NaCl)                                 8,5 g

Nước cất (H₂O) bổ sung đạt thể tích       1000 ml

pH 7,0                                                    ± 0,2

6.3.2  Chuẩn bị

Cân và hòa tan 8,5 g NaCl trong 1000 mL nước cất . Phân phối dung dịch pha loãng thập phân vào các ống nghiệm (5.2.3) sao cho sau khi khử trùng trong mỗi ống nghiệm chứa 9,0 ml. Sai số cho phép đo của thể tích cuối cùng sau khi khử trùng không được vượt quá ± 0,2 %;

7  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 12105:2018.

8  Cách tiến hành

8.1  Chuẩn bị

...

...

...

Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được khử trùng bằng 1 trong 2 cách sau:

- Tiệt trùng khô ở nhiệt độ (170 ± 10) °C không ít hơn 1 h trong tủ sấy (5.1.3) hoặc;

- Tiệt trùng hơi nước ở nhiệt độ (121 ± 3) °C không ít hơn 15 min trong nồi hấp áp lực (5.1.2),

8.1.2  Chuẩn bị mẫu

Dùng cân phân tích (5.1.6) cân 10 g mẫu (dạng rắn) hoặc dùng pipet với đầu tip vô trùng (6.2.6) hút 10 ml mẫu (dạng lỏng) cho vào bình thủy tinh (5.2.1) chứa 90 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị (6.3). Lắc trên máy lắc (5.1.5) từ 5 min đến 10 min sao cho vi sinh vật phân bố đồng đều trong dung dịch. Đề cho các phần tử nặng lắng xuống trong thời gian không nhiều hơn 3 min, nếu cần. Dung dịch phía trên được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu;

Dùng pipet với đầu tip vô trùng (5.2.6) hút 1 ml dịch huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm (5.2.3) chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị (6.3). Tránh chạm đầu tip vào dung dịch pha loãng. Trộn kỹ trên máy trộn Vortex (5.1.7) từ 5 s đến 10 s để có dung dịch mẫu độ pha loãng 10^-2. Lặp lại quy trình để thu được dung dịch mẫu ở các độ pha loãng thập phân tiếp theo 10^-3, 10^-4, 10^-5. Thường sử dụng độ pha loãng 10^-5, 10^-6, 10^-7 đối với phân bón vi sinh.

Sử dụng chủng vi khuẩn Burkholderia sp (VCCM 15545), Pseudomonas aeruginosa (VCCM 22613) và chủng nấm Talaromyces spp (VCCM 33911) có khả năng phân giải kali được đăng ký lưu giữ tại Trung tâm giống và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam.

CHÚ THÍCH 1: Hoạt hóa mẫu (nếu có) theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo kết quả chính xác.

8.2  Cấy và ủ

...

...

...

Dùng pipet với đầu tip vô trùng (5.2.6) lấy 0.1 ml dung dịch mẫu cho vào mỗi đĩa Petri chứa môi trường Aleksandrov đã chuẩn bị (6.2). Lặp lại quy trình với các dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng thập phân tiếp theo; mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa Petri;

Dùng que dàn mẫu (5.2.5) dàn đều dịch cáy trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt mà không chạm vào thành đĩa Petri, sử dụng một que dàn mẫu vô trùng cho mỗi đĩa Petri. Đậy nắp đĩa Petri và để yên trong khoảng 15 min ở nhiệt độ phòng.

Nuôi trong tủ ẩm (5.1.4) ở (28 ± 1) °C trong 5 ngày đến 7 ngày.

8.3  Đếm khuẩn lạc

Đếm các khuẩn lạc vi sinh vật phân giải kali ở hai độ pha loãng liên tiếp, trên các đĩa Petri có chứa không ít hơn 15 khuẩn lạc và không nhiều hơn 300 khuẩn lạc theo TCVN 4884: 2005.

Trên môi trường thạch Aleksandrov, vi sinh vật phân giải kali có vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc (Hình A.1. Phụ lục A).

9  Tính và biểu thị kết quả

- Mật độ tế bào vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra được tính bằng gam hay mililit, theo công thức:

A (CFU/g hay CFU/ml) = N/ (n₁Vf₁+...+ n_iVf_i)

...

...

...

A: là số khuẩn lạc (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1gam hay 1 mililit mẫu.

N: là tổng số khuẩn lạc có cùng đặc điểm hình thái đặc trưng cho vi khuẩn phân giải kali đếm được trên tất cả các đĩa Petri đã được chọn.

n₁: là số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ nhất.

n_i: là số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i.

f₁: là độ pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.

f_i: là độ pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ i.

V  là thể tích mẫu cấy vào trong mỗi đĩa.

- Làm tròn kết quả đến hai chữ số sau dấu phẩy.

- Biểu thị mật độ tế bào vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,00 đến 9,99 nhân với 10^x, trong đó x là số mũ của 10.

...

...

...

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử nghiệm đã dùng hoặc viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- Các kết quả thử nghiệm thu được.

PHỤ LỤC A: PHÁT HIỆN VI SINH VẬT PHÂN GIẢI KALI TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH ALEKSANDROV

...

...

...

Hình A.1. Các chủng vi sinh vật phân giải kali nuôi trên môi trường thạch Aleksandrov

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Feng Sun, Qiaojing Ou, Nan Wang, Zi xuan Guo, Yuyi Ou, Na Li, Changlian Peng (2020). Isolation and identification of potassium-solubilizing bacteria from Mikania micrantha rhizospheric soil and their effect on M. micrantha plants. Global Ecology and Conservation, 23 (2020) e01141.

[2] ISO 5306:1983, Fertilizers- Presentation of sampling reports (Phân bón - Trình bày báo cáo lấy mẫu).

[3] ISO/TR 7553:1987, Fertilizers- Sampling- Minimum mass of increment to be taken to be representative of total sampling unit (Phân bón - Lấy mẫu - Khối lượng tối thiểu có thể đại diện cho đơn vị lấy mẫu tổng).

[4] TCVN 7185:2002. Phân hữu cơ vi sinh vật.

[5] TCVN 10785:2015. Vi sinh vật - xác định khả năng phân giải kali.

...

...

...

[7] Giang N.V., Hoai T.T., Trang V.M., Trung K.H., Xuan T.D., Duong V.X., Huyen P.K., Diep V.T.N., Trung N.T., Khanh T.D., Thu P.T.L. (2020). Isolation and characterization of potassium solubilizing bacteria in some Vietnamese soil samples. International Journal on Emerging Technologies. 11(3): 639- 642.

[8] Đặng Thị Thanh Tâm, Nguyễn Thị Thu, Vũ Hiền Anh, Phạm Hồng Hiển, Nguyễn Xuân Cảnh (2023). Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Talaromyces spp. có khả năng phân giải kali khó tan. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 21(12): 1539-1548.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14115:2024 về Phân bón - Định lượng vi sinh vật phân giải kali bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc