Đặt các ống real-time PCR đã hoàn thành bổ sung hỗn hợp thuốc thử vào máy chu trình nhiệt (5.1.10) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt 2 bước, với 30 chu kỳ, theo hướng dẫn của nhà sản xuất thuốc thử SYBR Green Master Mix. Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi đặc hiệu trong phép thử này là 60 °C.

CHÚ THÍCH 1: Tham khảo Bảng 2 cho quy trình real-time PCR với chu trình nhiệt 2 bước.

Bảng 2 - Chu trình nhiệt 2 bước cho quy trình real-time PCR

Bước

Giai đoạn

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ

1

...

...

...

95

10 min

1

2

Biến tính

95

15 s

30

Gắn mồi và tổng hợp chuỗi

...

...

...

60 s

8.4.2  Phân tích kết quả

Quy trình real-time PCR đạt yêu cầu khi mẫu PC (6.5.1) cho giá trị Ct ≤ 28, mẫu NC (6.5.2) và mẫu nước cho giá trị Ct > 30 hoặc không có giá trị Ct.

Với mẫu TC có giá trị Ct ≤ 28, khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là B. pumilus (3.4).

Với mẫu TC có giá trị Ct > 30 hoặc không có giá trị Ct, khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là không phải B. pumilus.

Với mẫu thử có giá trị 28 < Ct ≤ 30, mẫu thử cần được kiểm tra lại nồng độ ADN, và cần thực hiện lại quy trình real-time PCR với chu trình nhiệt có bổ sung phân tích đường cong nóng chảy theo hướng dẫn của nhà sản xuất thuốc thử SYBR Green Master Mix. Phân tích kết quả quy trình realtime PCR với chu trình nhiệt có bổ sung phân tích đường cong nóng chảy, nếu giá trị Ct ≤ 30, Tm đạt từ 72 °C đến 80 °C, khác biệt ± 1 °C so với Tm của mẫu đối chứng dương, và thể hiện một đỉnh nóng chảy, thì khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là B. pumilus (3.4) (Tham khảo Phụ lục B).

CHÚ THÍCH 1: Giá trị Tm phụ thuộc vào máy chu trình nhiệt (5.1.10) và thuốc thử SYBR Green Master Mix. Tuy nhiên pác mẫu thử được khẳng định là B. pumilus khi giá trị Ct ≤ 30 và giá trị Tm của mẫu TC và mẫu PC trong cùng một quy trình real-time PCR không khác biệt quá 1 °C.

CHÚ THÍCH 2: Tham khảo Bảng 3 cho quy trình real-time PCR với chu trình nhiệt có bổ sung phân tích đường cong nóng chảy

Bảng 3 - Chu trình nhiệt cho quy trình real-time PCR có phân tích đường cong nóng chảy

...

...

...

Giai đoạn

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ

1

Biến tính ban đầu

95

10 min

1

...

...

...

Biến tính

95

15 s

40

Gắn mồi

60

30 s

Tổng hợp chuỗi

72

...

...

...

3

Phân tích đường cong nóng chảy

95

10 s

65

20 s

1

95

...

...

...

8.5  Định lượng Bacillus pumilus và biểu thị kết quả

Phương pháp định lượng B. pumilus được thực hiện theo TCVN 7715-2 (ISO 10272-2) và được tính theo Công thức (1):

(1)

Trong đó

N  số lượng CFU B. pumilus trong một đơn vị mẫu, ở dạng lỏng được tính bằng CFU trên mililit (CFU/mL), hoặc dạng khô được tính bằng CFU trên gam (CFU/g);

A  phần trăm (%) số mẫu thử được khẳng định là B. pumilus (8.4.2) trên tổng số PBC tham gia phép thử (8.4).

(Ví dụ trong 5 PBC tham gia phép thử khẳng định B. pumilus (8.4), có 4 mẫu thử được khẳng định là B. pumilus (8.4.2) thì A được tính là (4/5) x 100 % = 80 %.)

...

...

...

V  thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit (mL);

n₁, n₂  số đĩa có PBC được đếm ở hai độ pha loãng liên tiếp;

d  hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d = 1 khi mẫu thử ở dạng lỏng, không pha loãng];

Kết quả định lượng B. pumilus được làm tròn đến hai chữ số sau dấu phẩy.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm thực hiện theo TCVN 6404 (ISO 7218), bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

...

...

...

e) các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A: Hình thái khuẩn lạc B. pumilus trên môi trường BM

(Tham khảo)

Hình A.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng thuộc loài B. pumilus trên môi trường BM sau 36 h nuôi cấy

1 - B. pumilus ATCC 14884; 2 - B. pumilus ATCC 7061

Hình A.2. Hình thái khuẩn lạc một số loài gần gũi thuộc chi Bacillus trên môi trường BM sau 36 h nuôi cấy

...

...

...

Phụ lục B: Kết quả real-time PCR của B. pumilus

(Tham khảo)

Hình B.1 - Kết quả real-time PCR của B. pumilus với chu trình nhiệt 2 bước

Hình B.2 - Kết quả real-time PCR của B. pumilus với chu trình nhiệt có bổ sung phân tích đường cong nóng chảy

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] Dunlap, C. A. ,(2019). Taxonomy of registered Bacillus spp. strains used as plant pathogen antagonists. Biological control, 134, 82-86.

[3] Fu, X., Gong, L, Liu, Y., Lai, Q., Li, G., & Shao, Z. (2021). Bacillus pumilus group comparative genomics: toward pangenome features, diversity, and marine environmental adaptation. Frontiers in microbiology, 12, 571212.

[4] Kabir, M. S., Hsieh, Y. H., Simpson, S., Kerdahi, K., & Sulaiman, I. M., (2017). Evaluation of two standard and two chromogenic selective media for optimal growth and enumeration of isolates of 16 unique Bacillus species. Journal of food protection, 80(6), 952-962.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14112:2024 về Phân bón - Định lượng Bacillus pumilus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và real-time PCR