CHÚ THÍCH 3:

- Dung dịch chuẩn được sử dụng trong ngày.

- Tùy thuộc vào điều kiện trang thiết bị và hàm lượng polyphenol trong mẫu thử để xây dựng đường chuẩn sao cho phù hợp.

5  Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và

5.1  Cân phân tích, có độ chính xác đến ± 0,0001 g.

5.2  Nồi cách thủy.

5.3  Máy ly tâm.

5.4  Máy quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS).

...

...

...

5.6  Bình định mức dung tích 100 mL, 200 mL, 500 mL.

5.7  Máy trộn Vortex.

5.8  Ống chiết, bằng thủy tinh, dung tích 20 mL, có nút đậy kín và có thể chịu được khi ly tâm.

5.9  Ống đong có chia độ, bằng thủy tinh, dung tích 10 mL, chia độ 0,1 mL.

Trước khi sử dụng, ống đong cần được làm sạch bằng axit nitric khoảng 15 % ( theo thể tích), sau đó tráng kỹ bằng nước và làm khô trong tủ sấy ở 40 °C.

6  Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 9486: 2018.

6.2  Chuẩn bị mẫu

...

...

...

6.2.2  Phân bón dạng lỏng

6.2.2.1  Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được lắc đều.

6.2.2.2  Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn đều.

7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu

Dùng cân phân tích (5.1) cân từ 2,5 g đến 5 g mẫu đã được chuẩn bị theo (6.2.1 và 6.2.2.2), vào ống chiết dung tích 20 mL. Đối với mẫu dạng lỏng (6.2.2.1), dùng pipet (5.5) hút 2,5 mL đến 5 mL dung dịch mẫu và cân chính xác đến 0,0001 g để xác định khối lượng (g), sau đó tiến hành tương tự như đối với mẫu rắn và mẫu lỏng dạng sền sệt;

Cho ống chiết mẫu vào nồi cách thủy đặt ở 70 °C, thêm 5 mL hỗn hợp chiết metanol/nước (4.4) (đã được làm nóng trong nồi cách thủy ở 70 °C và trong ít nhất 30 min để cho hỗn hợp chiết cân bằng), đậy nắp và trộn trên máy trộn vortex (5.7).

Tiếp tục gia nhiệt ống chiết trong nồi cách thủy 10 min, trộn trên máy trộn vortex (5.7) sau 5 min đến 10 min.

CHÚ THÍCH 4: Quan trọng nhất là trộn đều kỹ các mẫu để đảm bảo chiết hết.

...

...

...

Gạn cẩn thận dịch nổi phía trên vào ống đong (5.9).

Lặp lại các bước chiết trên khoảng 3 lần, sau đó phối trộn các dịch chiết, thêm hỗn hợp chiết nguội metanol/ nước (4.4) đến 25 mL và trộn đều.

CHÚ THÍCH 5: Dịch chiết từ có thể bền ít nhất trong 24 h nếu được bảo quản ở 4°C. Để cho dịch chiết đạt đến nhiệt độ phòng trước khi tiến hành phép phân tích. Nếu chỉ một lượng nhỏ mẫu dạng hạt có thể bị lắng xuống trong quá trình bảo quản thì không cần phải tái huyền phù.

7.2  Dịch pha loãng

Dùng pipet (5.5) chuyển 1,0 mL dịch chiết mẫu (7.1) vào bình định mức dung tích 25 mL. Pha loãng đến vạch bằng nước và trộn đều.

7.3  Xác định polyphenol

Dùng pipet (5.5) thực hiện hai lần, mỗi lần chuyển 1,0 mL dung dịch chuẩn axit gallic theo Bảng 1 (4.10) vào các ống đong có chia độ (5.9) (Dung dịch này tương ứng với khoảng 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg và 5 μg axit gallic khan).

Dùng pipet (5.5) thực hiện hai lần, mỗi lần chuyển 1,0 mL nước vào các ống đong có chia độ (5.9). Đây là dung dịch so sánh mẫu trắng thuốc thử.

Dùng pipet (5.5) thực hiện hai lần, mỗi lần chuyển 1,0 mL dịch chiết mẫu đã được pha loãng (7.2) vào các ống đong có chia độ (5.9).

...

...

...

Để yên bình ở nhiệt độ phòng trong 60 min, sau đó đo mật độ quang trong cuvet có chiều dài đường quang 10 mm so với dung dịch mẫu trắng thuốc thử trên máy đo quang phổ (5.4) ở bước sóng 765 nm.

CHÚ THÍCH 6: Mẫu trắng thuốc thử phải có mật độ quang < 0,010. Các giá trị mẫu trắng cao hơn cho thấy có sự nhiễm từ nước, thuốc thử hoặc dụng cụ thủy tinh. Điều quan trọng nữa là mật độ quang của mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn. Nếu mật độ quang của mẫu cao hơn mật độ quang của dung dịch chuẩn axit gallic 5 μg thì lặp lại phép phân tích bằng cách tăng độ pha loãng (7.2).

8  Biểu thị kết quả

Hàm lượng polyphenol (X) trong mẫu phân bón, tính bằng mg/kg, theo công thức:

trong đó

a  là nồng độ của polyphenol trong dung dịch mẫu thử được xác định theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lit (mg/L);

f  là hệ số pha loãng;

V  là thể tích dung dịch định mức của mẫu sau khi chiết, tính bằng mililit (mL);

...

...

...

P_i  là độ tinh khiết của chất chuẩn

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của ít nhất hai lần thử được tiến hành song song với khối lượng cân khác nhau, sai lệch giữa chúng không được vượt quá theo quy định của AOAC (tùy thuộc vào mức nồng độ của chất thử) so với giá trị trung bình.

Kết quả hàm lượng polyphenol được lấy sau dấu phẩy hai chữ số

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm cần có đầy đủ những thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;

c) Kết quả thử nghiệm;

d) Mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin về hoạt chất polyphenol

- Công thức cấu tạo

Polyphenol

Axit gallic, một dạng của polyphenol

...

...

...

- Tên hóa học: IUPAC : 3,4,5 trihydroxybenzoic acid

- Công thức phân tử: C₇H₆O₅

- Khối lượng phân tử: 170,12 g/mol

- Nhiệt độ sôi: 250 °C

- Độ hòa tan: tan trong nước: 11,9 g/L, (20 °C) ở dạng anhydric, 15 g/L, (20 °C) ở dạng monohydrat

- Dạng bên ngoài: chất rắn, màu trắng, trắng vàng.

Phụ lục B

(Tham khảo)

...

...

...

Y = 0.0135733 +0.00000

r² = 0.99918

R(m)2 =0.99918

Đường chuẩn của axit galic trong phân bón có nồng độ từ 0,1 mg/L đến 5 mg/L

Standard Table

No

Sample ID

Type

...

...

...

Conc

WL 765.0

Wgt. Factor

Comments

1

1

Standard

0.0000

...

...

...

1.0000

2

2

Standard

0.1000

0.0021

1.0000

...

...

...

3

3

Standard

0.2000

0.0033

1.0000

4

...

...

...

Standard

0.5000

0.0076

1.0000

5

5

Standard

...

...

...

1.0000

0.0126

1.0000

6

6

Standard

2.0000

...

...

...

1.0000

7

7

Standard

5.0000

0.0682

1.0000

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005) Chè - Xác định các chất đặc trưng của chè xanh và chè xanh - Phần 1: Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè - Phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin - Ciocalteu

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14109:2024 về Phân bón - Xác định hàm lượng polyphenol tổng số - Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu