Dung dịch chuẩn phải được bảo quản trong bình tối màu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

Tùy thuộc vào điều kiện trang thiết bị và hoạt chất cytokinin trong mẫu thử để xây dựng đường chuẩn sao cho phù hợp.

5  Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau.

5.1  Cân phân tích, có độ chính xác đến ± 0,0001 g.

5.2  Bể siêu âm.

5.3  Thiết bị HPLC, được trang bị như sau:

- Detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,... hoặc tương đương);

- Hệ thống bơm cao áp;

...

...

...

- Máy tích phân hoặc máy vi tính;

- Cột RP C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, cỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương;

- Bộ bơm mẫu tự động hoặc bơm mẫu bằng tay.

5.4  Pipet, dung tích 1,0; 2,0; 5,0; 10 mL, có vạch chia đến 0,1 mL.

5.5  Giấy lọc, giấy lọc Whatman 0,45 μm hoặc tương đương.

5.6  Bình định mức, dung tích 10; 25; 50; 100; 1000 mL.

6  Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 9486:2018.

...

...

...

6.2.1  Phân bón dạng rắn: Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991).

6.2.2  Phân bón dạng lỏng

6.2.2.1  Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được lắc đều.

6.2.2.2  Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn đều.

7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu

Dùng cân phân tích (5.1) cân khoảng 2 g đến 5 g mẫu phân bón đã được chuẩn bị (6.2.1 và 6.2.2.2). Đối với mẫu dạng lỏng (6.2.2.1), dùng pipet (5.4) hút khoảng 2 mL đến 5 mL dung dịch mẫu, cân để xác định khối lượng, cho vào cốc dung tích 25 mL, thêm 2,5 mL dung dịch KOH 0,05 M (4.9) và 10 mL dung dịch metanol (4.6). Lắc đều, chuyển vào bình định mức dung tích 25 mL, thêm dung dịch metanol (4.6) đến vạch định mức. Đặt bình vào bể siêu âm trong thời gian khoảng 5 min, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc qua giấy lọc (5.5). Dung dịch thu được dùng để xác định hoạt chất cytokinin;

7.2  Điều kiện phân tích

Pha động:

...

...

...

Cột tách:

Cột tách pha đảo C18 (250 mm × 4,6 mm), 5μm;

Nhiệt độ cột:

25 °C;

Tốc độ dòng:

1,0 mL/min;

Thời gian phân tích:

20 min;

Bước sóng:

...

...

...

Thời gian (phút)

Metanol (4.6)
(% theo thể tích)

Dung dịch axit axetic 0,1.% (4.9)
(% theo thể tích)

0

35

65

15

55

45

...

...

...

35

65

7.3  Xác định hoạt chất cytokinin trong mẫu bằng HPLC

Ổn định hệ thống HPLC theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi hệ thống thiết bị ổn định, dùng bơm một dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất trong dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.12) cho đến khi số đo diện tích của pic chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 %. Sau đó, bơm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc (4.12) nồng độ từ thấp đến cao (Bảng 1) qua cột tách, dựng đường chuẩn hàm lượng hoạt chất cytokinin tương ứng với diện tích pic thu được.

Bơm dung dịch mẫu thử (7.1), lặp lại 2 lần. Xác định hàm lượng hoạt chất cytokinin dựa theo đường chuẩn đã được xây dựng. Nếu nồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử bằng metanol (4.6)

8  Biểu thị kết quả

Hàm lượng của từng loại cytokinin trong mẫu, X_i, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức (1).

(1)

...

...

...

(2)

trong đó:

X_0i  là nồng độ của các chất cytokinin trong mẫu tính theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lit (mg/L);

V  là thể tích dung môi chiết mẫu mililit (ml);

m  là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

P_i  là độ tinh khiết của chất chuẩn.

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của ít nhất hai lần thử được tiến hành song song, sai lệch giữa chúng không được vượt quá theo quy định của AOAC (tùy thuộc vào mức nồng độ của chất thử) so với giá trị trung bình.

Kết quả thử nghiệm thu được, lấy hai chữ số sau dấu phẩy.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;

c) Kết quả thử nghiệm;

d) Mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) Ngày thử nghiệm.

Phụ lục A

(Tham khảo)

...

...

...

A.1  Giới thiệu hoạt chất zeatin

- Công thức cấu tạo

- Tên hoạt chất: zeatin

- Tên hóa học: IUPAC: (E)-2-methyl-4-(7H-purin-6-ylamino)but-2-en-1-ol

- Công thức phân tử: C₁₀H₁₃N₅O

- Khối lượng phân tử: 219,24 g/mol

- Nhiệt độ sôi: 208 °C - 210 °C

- Độ hòa tan: tan trong nước

...

...

...

A.2  Giới thiệu hoạt chất zeatin riboside

- Công thức cấu tạo

- Tên hoạt chất: zeatin riboside

- Tên hóa học: IUPAC : 9-(P-D-Ribofuranosyl)-trans-zeatin, N6-(trans-4-Hydroxy-3-methyl-2- buten-1 -yl)adenosine

- Công thức phân tử: C₁₅H₂₁N₅O₅

- Khối lượng phân tử: 351,36 g/mol

- Nhiệt độ nóng chảy: 226 °C ~ 235 °C

- Độ hòa tan: tan trong nước

...

...

...

A.3  Giới thiệu hoạt chất kinetin

- Công thức cấu tạo

- Tên hoạt chất: kinetin

- Tên hóa học: IUPAC: N⁶-furfuryladenine

- Công thức phân tử: : C₁₀H₉N₅O

- Khối lượng phân tử: 215,21 g/mol

- Nhiệt độ sôi: 269 °C - 271 °C

- Độ hòa tan: tan trong nước

...

...

...

A.4  Giới thiệu hoạt chất benzylaminopurine

- Công thức cấu tạo

- Tên hoạt chất: benzylaminopurine

- Tên hóa học: IUPAC: N-(Phenylmethyl)-7H-purin-6-amine

- Công thức phân tử: : C₁₂H₁₁N₅

- Khối lượng phân tử: 225.255 g/mol

- Nhiệt độ nóng chảy: 230 °C - 233 °C

- Độ hòa tan: Khó tan trong nước (0,44 g/L ở 15 °C), tan ít trong ethyl alcohol; ổn định trong dung dịch axit, kiềm.

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về sắc kí đồ điển hình của hoạt chất nhóm cytokinin

Sắc ký đồ điển hình của hoạt chất nhóm cytokinin trong phân bón

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] METHOD OF HPLC ANALYSIS - Cytokinin 6BA 98 % TC - fertilizers -agrochemical

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13764:2023 về Phân bón - Xác định hàm lượng nhóm hoạt chất cytokinin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)