Σ^C là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa;

V là thể tích dịch cấy được sử dụng cho mỗi đĩa, tính bằng mililít (ml);

n₁ là số đĩa đếm được ở độ pha loãng thứ nhất;

n₂ là số các đĩa đếm được ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất.

Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa. Đối với số có ba chữ số, làm tròn chữ số thứ ba đến số gần 0 nhất. Trong trường hợp chữ số thứ ba là 5 thì làm tròn xuống nếu hai chữ số đầu tiên lá số chẵn và làm tròn lên nếu hai chữ số đầu tiên là số lẻ.

Kết quả là số vi sinh vật trên mỗi gam sản phẩm, được biểu thị bằng một số từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa tương ứng của 10.

11  Độ chụm

11.1  Yêu cầu chung

...

...

...

11.2  Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Chi tiết nghiên cứu liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được công bố ^[1],[2] và được tóm tắt trong Phụ lục B. Giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập được xác định sử dụng ba loại mẫu thức ăn chăn nuôi bị nhiễm ở hai mức. Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.

11.3  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm (số lượng Latobacillus trên gam hoặc mililít) đơn lẻ, độc lập (đã chuyển về log₁₀) hoặc tỷ số của hai kết quả thử nghiệm cao hơn đến thấp hơn trên thang chuẩn, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

11.4  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm (số lượng vi khuẩn lactobacillli trên gam hoặc mililít) đơn lẻ (đã chuyển về log₁₀) hoặc tỷ số của hai kết quả thử nghiệm cao hơn đến thấp hơn trên thang chuẩn, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

...

...

...

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn đến tiêu chuẩn này;

d) nhiệt độ ủ;

e) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với

f) mọi chi tiết về các tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

g) các kết quả thử nghiệm thu được, hoặc, nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các lưu ý về cách tiến hành

...

...

...

Trên thạch MRS đã axit hóa (AMRSA), các vi sinh vật khác Latobacillus được sử dụng làm phụ gia thức ăn chăn nuôi như Enterococcus hoặc Bacillus không thành thành khuẩn lạc. Chỉ một số loại nấm men, nấm mốc hoặc vi khuẩn Pediococcus là có thể hình thành các khuẩn lạc trong các điều kiện quy định. Các khuẩn lạc không phải là Latobacillus có thể dễ phân biệt được do hình thái khuẩn lạc khác nhau hoặc kiểm tra bằng kính hiển vi.

Tất cả các loại vi khuẩn probiotic Latobacillus được cho phép sử dụng trong các sản phẩm thức ăn chăn nuôi đều phát triển trên LAMVAB, đây là môi trường chọn lọc đối với Latobacillus. Tuy nhiên, trong số 88 loài Latobacillus, có một số loài không phát triển tốt hoặc không có trên LAMVAB (ví dụ: Latobacillus delbrueckii, Latobacillus helveticus và một số chủng Latobacillus acidophilus). Trên thạch LAMVAB, hầu hết các vi sinh vật khác được sử dụng làm phụ gia thức ăn không thể hình thành khuẩn lạc và chỉ một số loại nấm men, nấm mốc hoặc vi khuẩn Pediococcus có thể phát triển trong các điều kiện quy định. Các khuẩn lạc này có thể dễ phân biệt được bằng cách quan sát bằng kính hiển vi và không được sử dụng để đếm khuẩn lạc.

Chất chống nấm như nystatin (50 U/ml) có thể được thêm vào thạch MRS, AMRSA hoặc LAMVAB để ức chế nấm mốc và nấm men nhưng điều này có thể làm giảm cỡ khuẩn lạc của Latobacillus.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm gồm có 20 phòng thí nghiệm của 11 nước châu Âu tham gia tiến hành ở hai mức nhiễm khác nhau. Nghiên cứu được tổ chức vào năm 2002 và được phối hợp cùng Phòng thử nghiệm Khoa học Trung tâm ^[1],[2]. Đối với nghiên cứu liên phòng thử nghiệm, các mẫu thử đồng nhất được chuẩn bị bằng cách sử dụng mẫu thức ăn chăn nuôi có chứa vi khuẩn Latobacillus cùng với pediococcus, enterococcus và nấm men khoảng từ 2 x 10⁷ CFU/g (mức thấp) đến 1x108 CFU/g (mức cao) đã được phân tích. Dữ liệu độ chụm thu được từ nghiên cứu được tóm tắt trong Bảng B.1.

Bảng B.1 - Dữ liệu độ chụm thu được từ nghiên cứu hợp tác ^[1],[2]

...

...

...

Mẫu

MRS A (5.2.2.1)

MRS A + TTC (5.2.2.2)

Mức thấp

Mức cao

Mức thấp

Mức cao

Số lượng mẫu thử

2

...

...

...

2

2

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

11

11

9

11

Giá trị trung bình, tính bằng log₁₀ CFU/g

7,51

...

...

...

7,50

7,91

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, tính bằng log₁₀ CFU/g

0,24

0,24

0,26

0,12

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, CV_r, tính bằng %

3,14

...

...

...

3,42

1,46

Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 x s_r)

0,66

0,66

0,72

0,32

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, tính bằng log₁₀ CFU/g

0,38

...

...

...

0,39

0,32

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, CV_R tính bằng %

5,00

3,63

5,21

4,02

Giới hạn tái lập, R (= 2,8 x s_R)

1,05

...

...

...

1,10

0,89

Bảng B.1 (Kết thúc)

Thông số

Mẫu

AMRSA (5.2.2.3)

LAMVAB (5.2.2A)

Mức thấp

Mức cao

...

...

...

Mức cao

Số lượng mẫu thử

2

2

2

2

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

10

9

...

...

...

7

Giá trị trung bình, tính bằng log₁₀ CFU/g

7,40

8,03

7,02

7,68

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, tính bằng log₁₀ CFU/g

0,24

0,10

...

...

...

0,24

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, CV_r, tính bằng %

3,21

1,24

3,39

3,13

Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 x s_r)

0,67

0,28

...

...

...

0,67

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, tính bằng log₁₀ CFU/g

0,35

0,18

0,34

0,24

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, CV_R tính bằng %

4,75

2,24

...

...

...

3,13

Giới hạn tái lập, R (= 2,8 x s_R)

0,99

0,50

0,95

0,67

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] European Community project SMT4-CT98-2235. 'Methods for the official control of probiotics used as feed additives (vol. 1-3). 2002. Report EUR 20873/1-3. Office for Official Publications of the European Communities. ISBN 92-894-6249-3 (set)'

...

...

...

[3] Council Directive (79/373/EEC) of 2 April 1979 on the marketing of compound feeding stuffs (OJ No L 86, 6.4.1979, p.30)

[4] Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Volume 2 (ISBN 0-683-07893-3) by O.Kandler and N.Weiss, chapter “Genus Lactobacilli”

[5] Man J.C., de Rogosa, M. and E.M. Sharpe. 1960. Appl. Bact. 23, 130-135

[6] TCVN 4325 (ISO 6497), Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu

[7] TCVN 11923 (ISO/TS 17728), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13046:2020 về Thức ăn chăn nuôi - Phân lập và định lượng Lactobacillus spp.