Σ^C là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa;

V là thể tích dịch cấy được sử dụng cho mỗi đĩa, tính bằng mililít (ml);

n₁ là số đĩa đếm được ở độ pha loãng thứ nhất;

n₂ là số đĩa đếm được ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất.

Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa. Đối với số có ba chữ số, làm tròn chữ số thứ ba đến số gần 0 nhất. Trong trường hợp chữ số thứ ba là 5 thì làm tròn xuống nếu hai chữ số đầu tiên là số chẵn và làm tròn lên nếu hai chữ số đầu tiên là số lẻ.

Kết quả là số vi sinh vật trên mỗi gam sản phẩm, được biểu thị bằng một số từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa tương ứng của 10.

11  Độ chụm

11.1  Yêu cầu chung

...

...

...

11.2  Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Chi tiết nghiên cứu liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được công bố (xem Tài liệu tham khảo [1], [2]) và được tóm tắt trong Phụ lục B. Giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập được xác định, sử dụng ba loại mẫu thức ăn chăn nuôi bị nhiễm ở hai mức. Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.

11.3  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm (số lượng Bifidobacterium trên gam hoặc mililit) đơn lẻ, độc lập (đã chuyển về log₁₀) hoặc tỷ số của hai kết quả thử nghiệm cao hơn đến thấp hơn trên thang chuẩn, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

11.4  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm (số lượng Bifidobacterium trên gam hoặc mililit) đơn lẻ (đã chuyển về logio) hoặc tỷ số của hai kết quả thử nghiệm cao hơn đến thấp hơn trên thang chuẩn, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

...

...

...

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn đến tiêu chuần này;

d) nhiệt độ ủ;

e) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với

f) mọi chi tiết về các tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

g) các kết quả thử nghiệm thu được, hoặc, nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

h) môi trường (xem 5.2.1).

Phụ lục A

(Tham khảo)

...

...

...

Môi trường thạch MRS cho phép tất cả các vi khuẩn lactic và cả các loài vi sinh vật khác phát triển. Việc bổ sung TTC vào thạch MRS là cách tốt nhất để phân biệt, ví dụ: Bifidobacterium có màu đỏ khác nhau sau khi ủ yếm khí.

Trên môi trường thạch MRS đã axit hóa (AMRSA) các vi sinh vật khác ngoài Bifidobacterium được sử dụng làm phụ gia thức ăn chăn nuôi như vi khuẩn Enterococcus hoặc Bacillus không hình thành khuẩn lạc. Chỉ một số loại nấm men, nấm mốc hoặc vi khuẩn Lactobacillus và Pediococcus lả có thể hình thành các khuẩn lạc trong các điều kiện quy định.

Cần sử dụng môi trường MRS chọn lọc bổ sung mupirocin nếu Bifidobacterium có nồng độ thấp hơn các vi sinh vật probiotic khác.

Chất chống nấm như nystatin (50 u/ml) có thể được thêm vào thạch MRS, AMRSA hoặc MRS + TTC để ức chế nấm mốc và nấm men.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm gồm có 17 phòng thử nghiệm của 11 nước châu Âu tham gia tiến hành ở hai mức nhiễm khác nhau (thấp và cao). Phép thử được tổ chức vào năm 2002 và được phối hợp cùng Phòng thử nghiệm Khoa học Trung tâm [11. Đối với nghiên cứu liên phòng thử nghiệm, các mẫu thử đồng nhất được chuẩn bị bằng cách sử dụng thức ăn chăn nuôi có chứa Bifidobacterium là thành phần duy nhất trong các mẫu bị nhiễm ở mức cao (tùy thuộc vào môi trường được sử dụng đối với MRS là 6,6 x10⁶ và môi trường Bifidobacterium chọn lọc là 9,5 x 10⁷) và kết hợp với vi khuẩn Pediococcus trong mẫu thử cô đặc thấp hơn (tùy thuộc vào môi trường được sử dụng, đối với MRS là 1,3 x 10⁵ và môi trường Bifidobacterium chọn lọc là 1,9 x 10⁶). Dữ liệu độ chụm thu được từ phép thử được tóm tắt trong Bảng B.1.

...

...

...

Thông số

Mẫu

MRS A

(5.2.2.1)

MRS A + TTC

(5.2.2.2)

AMRSA

(5.2.2.3)

BSM

...

...

...

Mức thấp

Mức cao

Mức thấp

Mức cao

Mức thấp

Mức cao

Mức thấp

Mức cao

Số lượng mẫu

...

...

...

2

2

2

2

2

2

2

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

5

...

...

...

7

9

6

9

8

10

Giá trị trung bình, tính bằng log₁₀ CFU/g.

5,30

7,69

...

...

...

7,49

5,08

7,53

5,27

7,81

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, tính bằng log₁₀ CFU/g

0,15

0,13

0,27

...

...

...

0,31

0,12

0,33

0,09

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, C.V_r, tính bằng %

2,90

1,74

5,26

2,42

...

...

...

1,60

6,30

1,19

Giới hạn lặp lại, r

0,43

0,38

0,77

0,51

0,87

...

...

...

0,93

0,26

Độ lệch chuẩn tái lập, Sr, tính bằng logio CFU/g

0,24

0,25

0,29

0,39

0,44

0,26

...

...

...

0,21

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, CV_R, tính bằng %

4,52

3,30

5,51

5,21

8,74

3,50

6,55

...

...

...

Giới hạn tái lập, R

0,67

0,71

0,81

1,09

1,24

0,74

0,97

0,57

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] European Community project SMT4-CT98-2235. 'Methods for the official control of probiotics used as feed additives (vol. 1-3). 2002. Report EUR 20873/1-3. Office for Official Publications of the European Communities. ISBN 92-894-6249-3 (set)'

[2] Leuschner R.G.K., J. Bew, V. Coeuret, P. Simpson, R.P- Ross, C. Stanton. 2003. A collaborative study of a method for the enumeration of probiotic bifidobacteria in animal feed. Int. J. Food Microbiol. 83, 161-170

[3] Council Directive (79/373/EEC) of 2 April 1979 on the marketing of compound feeding stuffs (OJ No L)

[4] TCVN 4325 (ISO 6497), Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu

[5] TCVN 11923 (ISO/TS 17728), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13044:2020 về Thức ăn chăn nuôi - Phân lập và định lượng Bifidobacterium spp.