Đệm 1x (70 mM Tris HCl; 16 mM (NH₄)₂SO₄; 2,5 mM MgCI₂ )

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Phản ứng được thực hiện bởi máy PCR theo chương trình như sau:

95 °C trong 1 phút

94 °C trong 30 giây

50 °C(SgCOIIa/ SgCOIIb), 53 °C(SgCOI1/ SgCOI2), 57 °C

(SgCOI3/ SgCOI 4) trong 30 giây

72 °C trong 1 phút

72 °C trong 5 phút

35 chu kì

...

...

...

Sảm phẩm PCR được điện di 30 phút với 2 % agrose trong đệm TBE 1X. Nhuộm mẫu (ví dụ với Ethidium bromide 1 μg/ml) và soi dưới tia UV.

Mẫu dương tính khi cho ra sản phẩm PCR có kích thước 299 bp (SgCOH/ SgCOI2), 803 bp (SgCOI3/ SgCOI 4), 450 bp (SgCOIIa/ SgCOIIb).

6.2.2  Phương pháp Real-time PCR

Bước 1: Tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ sâu non hoặc trưởng thành hoặc sản phẩm bị hại là lúa mì và bột.

Đối với sâu non hoặc trưởng thành sử dụng kít tách chiết, ví dụ như DNeasy Tissue Kít.

Đối với sản phẩm bị hại là lúa mì hoặc bột sử dụng kít tách chiết, ví dụ như DNeasy Plant Mini Kít.

Bước 2: Khuyếch đại gen

Thành phần chạy phản ứng real time PCR cần tổng số 10 μl bao gồm:

...

...

...

0,5 pM mồi

1 pmol Taqman probe (5’FAM - TGACGGAACACCTGGTC -TMR- 3’)

DNA khuôn

Bảng 2: Danh sách đoạn mồi sử dụng trong quá trình chạy real time PCR

(Obrepalska-Steplowska et al.)

Mồi

Trình tự (5' - 3’)

Vùng gen mã hóa

Chiều dài sản phẩm gen

...

...

...

COIISG1

TGATAACCGAACACCAATTAAC

mtCOII

125 bp

68 °C

COIISG2

TTAGACGACCAGGTGTTCCGTC

qCOIISG1

TCCTGAACAATCCCAAGAATAAG

...

...

...

114 bp

60 °C

qCOIISG2

GATTTCTGAGCATTGACCAAAG

Chu trình nhiệt của phản ứng real time PCR: Phản ứng được thực hiện bởi máy real time PCR theo chương trình như sau:

95 °C trong 2 phút

95 °C trong 20 giây

60 °C trong 30 giây

72 °C trong 1 phút

...

...

...

40 chu kì

Bước 3: Đọc kết quả

Kết quả được phân tích bởi phần mềm.

6.3  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài mọt thóc Sitophilus granarius Linnaeus khi:

- Mẫu sâu non hoặc trưởng thành có đặc điểm điểm hình thái phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở điều 6.1.1.3 hoặc 6.1.2.3.

hoặc

- Phương pháp PCR hoặc realtime-PCR cho kết quả là dương tính.

7  Báo cáo kết quả

...

...

...

- Thông tin về mẫu giám định.

- Tên khoa học của loài

- Phương pháp giám định

- Tài liệu giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục B.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

...

...

...

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên khoa học: Sitophilus granarius Linnaeus

- Tên tiếng Việt: Mọt thóc

- Vị trí phân loại:

Ngành

: Arthropoda

Lớp

: Insecta

Bộ

...

...

...

Họ

: Dryophthoridae

Giống

: Sitophilus

A.2  Phân bố

Châu Á: Afghanistan, India, Iran, Iraq, Isreal, Japan, Kazakhstan, Malaysia, Saudi Arabia, Sri Lanka, Syria, Thailand, Turkey, Yeman

Châu Âu: Austria, Belgium, Bosnia- Hercegovina, Denmark, France, Greece, Germany, Hungary, Italy, Poland, Spain, United Kingdom, Ukraine, Sweden, Slovenia, Serbia

Châu Đại Dương: Australia

Châu Mỹ: Argentina, Chile, Falkland Islands

...

...

...

A.3  Ký chủ

Mọt thóc gây hại chủ yếu cho các sản phẩm sau thu hoạch hoặc cận thu hoạch. Ký chủ chính của loài mọt thóc là các họ Asteraceae: Helianthus annuus (hướng dương); Fabaceae: Arachis hypogaea (lạc), Cicer arietinum (đậu gà), Vicia faba (đậu răng ngựa); Poaceae: Avena sativa (yến mạch), Oryza sativa (lúa), Panicum (kê), Pennisetum (có lông vũ), Secale cereale (lúa mạch đen), Sorghum bicolor (cao lương), Zea mays (ngô).

A. 4  Đặc điểm sinh học

- Trưởng thành của S. granarius bò rất nhanh. Trứng, sâu non và nhộng của loài này nằm trong hạt nên chúng có khả năng phát tán rất nhanh thông qua việc vận chuyển các loại hàng hoá này.

- Trưởng thành sống trung bình từ 7 tháng đến 8 tháng. Trưởng thành cái đẻ khoảng 150 trứng và cao nhất có thể đạt tới 300 trứng, ở điều kiện mùa hè, S. granarius có thể hoàn thành vòng đời từ 4 tuần đến 6 tuần nhưng trong điều kiện mùa đông, vòng đời có thể kéo dài từ 17 tuần đến 21 tuần.

- Khi không có thức ăn, ở điều kiện khí hậu mát, trưởng thành có thể sống ít nhất là 1 tháng

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

...

...

...

Cơ quan giám định
---------

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
---------------

………., ngày ... tháng ... năm 20…...

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hoá:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

...

...

...

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12709-2-2:2019 về “Quy trình giám định côn trùng và nhện nhỏ gây hại thực vật - Phần 2 -2: Yêu cầu cụ thể đối với mọt thóc Sitophilus granarius Linnaeus”.

13. Kết quả giám định:

...

...

...

Họ: Dryophthoridae

Bộ: Coleoptera

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT
(hoặc người giám định)
(ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ
(ký, ghi rõ họ và tên đóng dấu)

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Nghị định 86/2012/NĐ-CP. Quy định chi tiết và hướng dẫn thi hành một số điều của luật đo lường.

[2] QCVN 01-107:2012/BNNPTNT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định mọt thóc Sitophilus granarlus L.

...

...

...

[4] TCVN 1-2: 2008, Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[5] Aleksandra Obrepalska-Steplowska, Katarzyna Nowaczuk, Marcin Hoysz, Magdalena Gawlak, Jan Nawrot. 2011. Molecular techniques for detection of granary weevil (Sitophilus granarius L.) in wheat and flour. Food Additives and Contaminants, 2008, 25(10), pp. 1179-1188.

[6] CABI, 2018. Crop Protection Compedium

(https://www.cabi.org/cpc/datasheet/10850)

[7] Dinuttă A., Bunescu H., Proorocu M., Bodis I. and Oros S. 2008. Reseaches concering the external morphology of granary weevil’s adult (Sitophilus granarius L), a major pests of the stored cereals. Bulletin UASVM, Agriculture 65 (1) 2008. pISSN 1843 - 5246; elSSN 1843 - 5386.

[8] Elda G. And Fava A. 1995. Egg general morphology and eggshell fine organization of the grain weevil Sitophilus granarius (L.) (Coleóptera: Curculionidae). Entomologica, Bari, 29, (1995): 87- 98.

[9] Fouda, M. A., Al - Dali A. G. and Ghannam I. A. 2016. Ultrastructure of sensory receptors on the antennae and mouthparts of the adult, Sitophilus oryzae L. and Sitophylus granarles L. (Coleoptera: Curculionidae). Jounal of Nuclear Technology in Applied Science. ISSN 2314 - 8209.

[10] Gorham J. R., 1991. Insect and mite pests In food. U. S. Government printing office. Washington, D. C. 20402. Page 115- 136.

[11] Ki - Jeong Hong, Wonhoon Lee, Yuong - Ju Park and Jeong - Oh Yang. 2018. First confirmation of the distribution of rice weevil, Sitophilus oryzae, in south korea. Journal of Asia- Pacific Biodiversity 11 (2018) 69-75.

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12709-2-2:2019 về Quy trình giám định côn trùng và nhện nhỏ hại thực vật - Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với mọt thóc Sitophilus granarius Linnaeus