Trong đó:

A_max

là mức hấp thụ cực đại xác định được theo đồ thị hấp thụ (ở đây: ở bước sóng 333 nm);

M

là khối lượng mol phân tử của OTA, tính bằng gam trên mol (M = 403,8 g/mol);

ɛ

là hệ số hấp thụ mol, tính bằng mét vuông trên mol, của OTA trong dung dịch toluen/axit axetic (4.11), (ở đây: 544 m²/mol);

b

là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng cm.

...

...

...

4.22  Dung dịch OTA trung gian

Chuẩn bị 10 ml dung dịch chuẩn OTA gốc pha loãng để dựng đồ thị hiệu chuẩn bằng cách pha loãng 100 lần dung dịch chuẩn OTA gốc (4.20) với pha động (4.18). Dùng pipet lấy 100 µl dung dịch OTA gốc cho vào bình (ống) định mức, làm bay hơi dung dịch gốc bằng cách thổi nhẹ nitơ (4.21) ở 40 °C và thêm pha động (4.18) đến vạch.

CHÚ THÍCH: Để hòa tan hoàn toàn OTA trong pha động, đầu tiên chỉ cho pha động vào bình định mức khoảng 1/3 thể tích, hòa tan OTA và sau đó thêm pha động đến vạch và lắc.

4.23  Dung dịch hiệu chuẩn

Từ dung dịch chuẩn OTA trung gian (4.22) chuẩn bị sáu dung dịch hiệu chuẩn với 6 nồng độ bằng cách cho các thể tích dung dịch chuẩn OTA gốc pha loãng như trong Bảng 1 dưới đây vào 6 bình định mức và thêm pha động (4.18) đến vạch.

Bảng 1 - Các dung dịch hiệu chuẩn (4.23) được khuyến cáo để xác định OTA

Thứ tự các bình dung dịch hiệu chuẩn

Dung dịch OTA trung gian (4.22)

(µl)

...

...

...

(ml)

Nồng độ OTA

(ng/ml)

1

50

10,0

1

2

250

...

...

...

5

3

500

10,0

10

4

750

10,0

15

...

...

...

1 000

10,0

20

6

1 250

10,0

25

4.24  IAC với kháng thể đặc hiệu cho OTA

IAC chứa kháng thể đặc hiệu cho OTA. Các cột OTA phải có khả năng giữ không nhỏ hơn 100 ng OTA. Mức độ thu hồi OTA không được nhỏ hơn 85 % khi áp dụng mức 5 ng OTA trong 50 ml hỗn hợp gồm 4 thể tích dung môi chiết (4.16) và 96 thể tích PBS sẵn để sử dụng (4.14).

...

...

...

OTA trong dung dịch axeticitril/axit axetic băng theo tỷ lệ 99/1 (thể tích). Nồng độ OTA trong dung dịch thêm chuẩn phụ thuộc vào mức yêu cầu. Thể tích dung dịch thêm chuẩn nên ở khoảng 500 µl. Dung dịch thêm chuẩn có thể được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn OTA gốc (4.20) bằng cách tương tự như khi chuẩn bị dung dịch chuẩn OTA trung gian (4.22).

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các trang thiết bị thí nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm, như ống đong định mức, cốc, pipet định mức.

5.2  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.3  Máy lắc ngang hoặc lắc đứng.

5.4  Hệ thống hút chân không SPE tự động.

5.5  Bình định mức, dung tích 5 ml, 10 ml, 100 ml.

5.6  Giấy lọc đã được gấp nếp trước, giữ được hạt 30 µm.

...

...

...

5.8  Phễu thủy tinh, đường kính trong 9 cm.

5.9  Bình chứa, bằng polypropylen, thích hợp để gắn trên đỉnh cột IAC, dung tích từ 50 đến 75 ml.

5.10  Xyranh bằng chất dẻo, dung tích 5 ml.

5.11  Micropipet đã hiệu chuẩn, dung tích 100 µl, 500 µl và 1000 µl.

5.12  Hệ thống lọc dung môi hút chân không, phù hợp với bộ lọc 47 mm.

5.13  Bộ lọc vi sợi thủy tinh, giữ được hạt cỡ 1,6 µm.

5.14  Máy trộn vortex.

5.15  Xyranh lọc dùng cho HPLC, bằng nylon kích thước lỗ 0,45 µm.

5.16  Bể siêu âm.

...

...

...

5.18  Hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC bao gồm:

- Bơm không xung, tốc độ bơm 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min;

- Hệ thống bơm mẫu, bằng tay hoặc bộ lấy mẫu tự động, có kim thích hợp để bơm 100 µl đến 300 µl;

- Detector huỳnh quang, thích hợp để đo ở bước sóng kích thích 333 nm và phát xạ ở 467 nm;

- Bộ máy vi tính.

5.19  Cột phân tích HPLC pha đảo, C18 cột pha đảo phù hợp để tách hiệu quả OTA ra khỏi các thành phần khác; Cột có đầy đủ các đặc tính về kích thước và đặc tính pha tĩnh dài 250 mm x đường kính trong 4,6 mm x cỡ hạt 5 µm.

5.20  Tiền cột (cột bảo vệ), có cùng vật liệu pha tĩnh như cột phân tích, đường kính trong 4,0 mm, pha tĩnh với cỡ hạt 5 µm.

5.21  Máy đo quang phổ UV.

...

...

...

6.1  Chiết OTA

- Cân 25,0 g mẫu thử chính xác đến 0,1 g, cho vào một hộp chứa đủ lớn có nắp, ví dụ: Bình dung tích 500 ml có nắp vặn (5.7).

CHÚ THÍCH 1: Mẫu nghiên cứu liên phòng thí nghiệm^[1] được nghiền nhỏ đến kích thước hạt khoảng 0,5 mm.

- thêm 200,0 ml dung môi chiết (4.16), đóng chặt nắp và lắc mạnh bằng tay trong vài giây để cho vật liệu phân tán đều (kiểm tra trực quan).

- đặt hộp chứa lên máy lắc (5.3) trong 40 min, chọn tốc độ sao cho các thành phần được trộn đều mà không bị bám trên thành bình. Cách khác là dùng bể siêu âm xử lý trong 15 min; trong trường hợp này lắc nhanh hộp chiết bằng tay trong vài giây.

- để yên mẫu cho lắng xuống sau khi lắc.

- lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.6) và thu dịch chiết đã lọc vào bình có nắp vặn 250 ml (5.7), và

- lấy khoảng 10 ml dịch chiết đã lọc cho vào hệ thống lọc hút chân không và lọc qua bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.13) có sử dụng hút chân không nhẹ (5.12). Gạn bỏ lượng dịch chiết này và lọc một lần nữa tất cả phần dịch chiết còn lại và thu vào bình có nắp vặn 250 ml (5.7) có được dịch chiết trong suốt để phân tích tiếp. Tiến hành ngay công đoạn làm sạch qua cột IAC (6.2).

CHÚ THÍCH 2: Không sử dụng chân không mạnh lúc mới bắt đầu lọc để không làm vẩn đục dịch chiết sau lọc.

...

...

...

- dùng một IAC (cột ái lực miễn dịch 4.24) cho từng dịch chiết;

- gắn cột vào bình chứa (5.9), không tháo dung dịch bảo quản cột ra khỏi cột;

- cho 4,00 ml dịch chiết đã lọc hai lần vào bình định mức 100 ml (5.5), thêm PBS sẵn để sử dụng (4.14) đến vạch và lắc;

- cho 50,0 ml dịch chiết đã pha loãng vào bình chứa đã gắn ở cột IAC; Lượng dịch này tương đương với 2,00 ml dịch chiết đã lọc hai lần chưa pha loãng;

- mở khóa của cột IAC;

- cho dịch chiết đi qua cột IAC với tốc độ dòng chảy ổn định cho đến khi toàn bộ dịch chiết đi hết qua cột ái lực miễn dịch và mẻ dung môi cuối cùng chạm đáy cột;

- sau khi dịch chiết đã chảy hết hoàn toàn qua cột, rửa cột IAC bằng 10 ml nước; đảm bảo nước có pH trung tính;

- thổi không khí qua IAC (ví dụ sử dụng một ống bơm lớn nối với cột) để thổi nước dư thừa;

- đặt bình định mức 5 ml (5.5) phía dưới IAC và thêm 0,75 ml metanol (4.2) vào IAC;

...

...

...

- sau khi những giọt metanol cuối cùng đi qua IAC, để cho metanol ở lại trong IAC trong khoảng 1 min; sau đó cho thêm 0,75 ml metanol (4.2) vào cột và tiếp tục thu lấy dịch rửa giải, cho thêm 0,50 ml nước (nước loại 1 trong TCVN 4851);

- cẩn thận thổi không khí qua IAC để thu lấy tối đa lượng metanol và nước đã thêm vào cột;

- thêm ngay 1,5 ml dung dịch axit axetic (4.17) vào bình định mức; và

- thêm nước (nước loại 1 trong TCVN 4851) vào đầy đến vạch bình định mức và lắc bằng máy vortex. Trong trường hợp dịch chiết mẫu bị đục, tiến hành lọc các dung dịch thử qua bộ lọc xyranh dùng cho HPLC (5.15). Dung dịch này có thể được sử dụng trực tiếp làm dung dịch thử.

9  Độ chụm

9.1  Nghiên cứu cộng tác

Chi tiết của việc nghiên cứu liên phòng thí nghiệm về độ chụm của phương pháp được thể hiện trong [1]. Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng thí nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.

9.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, trên cùng một chất liệu thử, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

...

...

...

 = 39 µg/kg

r = 4,54 µg/kg

 = 62 µg/kg

r = 5,8 µg/kg

 = 150 µg/kg

r = 18,5 µg/kg

 = 240 µg/kg

r = 27,7 µg/kg

 = 338 µg/kg

...

...

...

Mối tương quan giữa r và  có thể được ước lượng một cách đầy đủ bằng công thức sau:

có nghĩa là độ lệch chuẩn lặp lại tương đối là không đổi trong dải làm việc.

9.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, trên cùng một mẫu thử do hai phòng thí nghiệm khác nhau thực hiện, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Bảng 3 - Độ chụm của dữ liệu giới hạn tái lập

 = 39 µg/kg

R = 14,8 µg/kg

 = 62 µg/kg

...

...

...

 = 150 µg/kg

R = 61,2 µg/kg

 = 240 µg/kg

R = 93,8 µg/kg

 = 338 µg/kg

R = 144 µg/kg

Mối tương quan giữa R và  có thể được ước lượng một cách đầy đủ bằng công thức sau:

nghĩa là độ lệch chuẩn tương đối tái lập không đổi trong dải làm việc.

...

...

...

Báo cáo kết quả thử nghiệm phải ghi rõ:

a) thông tin cần thiết để xác định đầy đủ mẫu (loại mẫu, mẫu gốc, mẫu chỉ định;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày lấy mẫu và việc xử lý mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày phân tích;

f) kết quả thử nghiệm thu được và đơn vị biểu thị kết quả;

g) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được;

h) các tình huống bất thường quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

...

...

...

Phụ lục A

(tham khảo)

Ví dụ về các sắc đồ

Hình A.1 - Ví dụ sắc đồ (~ 200 µg/kg OTA trong thức ăn chăn nuôi)

Phụ lục B

(Tham khảo)

...

...

...

Các dữ liệu nêu trong Bảng B.1 và Bảng B.2 thu được trong một nghiên cứu liên phòng thí nghiệm [1] theo Hướng dẫn của AOAC về nghiên cứu hợp tác để đánh giá xác nhận các đặc tính của phương pháp phân tích [2], [3]. Mẫu thử được nêu trong Bảng B.3.

Bảng B.1 - Đặc tính hiệu năng từ nghiên cứu hợp tác OTA trong thức ăn chăn nuôi

Chỉ tiêu

Ochratoxin A

Bộ mẫu (nc = bị nhiễm tự nhiên)

1

2

3

4(nc)

...

...

...

6(nc)

Năm thực hiện nghiên cứu hợp tác

2007

Số lượng phòng thí nghiệm

29

Số lượng mẫu (mẫu kép)

1

1

1

...

...

...

1

1

Số lượng phòng thí nghiệm còn lại sau loại trừ ngoại lệ

29

28

26

28

29

29

...

...

...

n.a.

1

2

1

0

0

Số kết quả được chấp nhận

29

28

...

...

...

28

29

29

Giá trị trung bình (µg/kg)

n.d.

62

240

39

150

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, (µg/kg)

n.a.

2,07

9,91

1,62

6,60

16,6

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, (%)

n.a.

...

...

...

4,12

4,15

4,40

4,47

Giới hạn lặp lại r, (r = 2,8 x s_r) (µg/kg)

n.a.

5,80

27,7

4,54

...

...

...

44,8

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, (µg/kg)

n.a.

8,90

33,5

5,30

21,9

51,2

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, (%)

...

...

...

14,3

13,9

13,6

14,6

15,2

HORAT (được sửa đổi theo Thompson [4])

n.a.

0,6

0,7

...

...

...

0,7

0,8

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s_R) (µg/kg)

n.a.

24,9

93,8

14,8

61,3

143

...

...

...

-

82

79

-

-

-

Bộ mẫu 1 là mẫu trắng;

Bộ mẫu 2 và 3 là mẫu thêm chuẩn;

Các mẫu 4, 5 và 6 bị nhiễm tự nhiên;

...

...

...

Mức báo cáo n.d. (hoặc "nhỏ hơn" hoặc < LOD) có khác nhau từ LOD đạt được trong từng trường hợp và n.a. = không áp dụng.

Bảng B.2 - Đặc tính hiệu năng từ nghiên cứu liên phòng về OTA trong thức ăn chăn nuôi (đã hiệu chính về độ thu hồi - chỉ để biết thông tin)

Chỉ tiêu

Ochratoxin A

Bộ mẫu (nc = ô nhiễm tự nhiên)

4(nc)

5(nc)

6(nc)

Năm thực hiện nghiên cứu hợp tác

...

...

...

Số lượng phòng thí nghiệm

30

Số lượng mẫu (mẫu kép)

1

1

1

Số lượng phòng thí nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

26

29

...

...

...

Số lượng phòng thí nghiệm ngoại lệ

4

1

0

Số kết quả được chấp nhận

26

29

30

Giá trị trung bình (µg/kg)

...

...

...

186

420

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r (µg/kg)

1,76

8,90

19,1

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, (%)

3,61

4,79

...

...

...

Giới hạn lặp lại r, (r = 2,8 x s_r) (µg/kg)

4,93

24,9

53,5

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, (µg/kg)

2,73

10,1

26,8

HORAT (được sửa đổi theo Thompson [4])

...

...

...

0.3

0.4

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, (%)

5,60

5,46

6,38

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s_R) (µg/kg)

7,64

28,3

...

...

...

CHÚ THÍCH: Các mẫu 4, 5 và 6 bị nhiễm tự nhiên. Các kết quả được thể hiện là kết quả sau khi đã hiệu chỉnh cho độ thu hồi với giá trị thu hồi trung bình từ mẫu 2 và mẫu 3 (xem Bảng A). Thông tin này chỉ vì mục đích kiểm soát. Kết quả phải được so sánh với cơ sở điều chỉnh thu hồi.

Bảng B.3 - Thành phần vật liệu thử của phép thử liên phòng thử nghiệm^[1]

Vật liệu thử

Thành phần và số lượng (%)

1 - 3

Lúa mạch 26 %

Gạo 19 %

Hạt lanh 8 %

Đậu nành 11 %

...

...

...

Củ cải đường 11 %

4 (nc)

Yến mạch dạng mảnh 10 %

Lúa mạch 1 %

Củ cải đường 7 %

Bột ngô 54 %

Hạt lanh 4 %

Gạo 24 %

5 (nc)

...

...

...

Củ cải đường 17 %

Bột ngô 23 %

Đậu nành 31 %

Gạo 17 %

6 (nc)

Lúa mạch 9 %

Bánh sơ củ cải đường 14 %

Bột ngô 40 %

Hạt lanh 1 %

...

...

...

Ngũ cốc dạng mảnh 22 %

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Stroka, J., Ambrosio, M., Donchva, I., Lerda, D., Mischke, C., Breidbach, A., (2009) Validation of an Analytical Method to Determine the Content of Ochratoxin A in Animal Feed - Report EUR 23657 EN -ISBN 978-92-79-11063-4, LA-NA-23657-EN-C, 10.2787/94797, JRC49205, European Commission, Brussels, Belgium

[2] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, p. 23-51

[3] Horwitz, W. (1995), Pure and Applied Chemistry, 67, p. 331-343

[4] Thompson, M. (2000), Analyst, 125 p. 385-386

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12599:2018 (EN 16007:2011) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định ochratoxin A bằng phương pháp làm sạch qua cột ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang