Trong đó:

A_max

là độ hấp thụ cực đại xác định được trên đường chuẩn độ hấp thụ (ở đây là: bước sóng 220 nm);

M

là khối lượng mol của deoxynivalenol (M = 296,3 g/mol);

ĸ

là hệ số hấp thụ mol của deoxynivalenol trong axetonitril (4.1), (ở đây là: 681 m²/mol ± 12,6 m²/mol [1]);

d

là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng xentimet (ở đây là: 1 cm).

...

...

...

ρ_DON (~ 250 μg/ml) = ρ_DON (~ 25 μg/ml) x 10

(2)

Dung dịch có thể được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C, tối đa 3 tháng hoặc ở dưới -18 °C ít nhất 6 tháng.

CHÚ THÍCH: Việc chuẩn bị dung dịch gốc có thể được thực hiện theo phương pháp khối lượng bằng cách cân chính xác vật liệu chuẩn DON và dung môi được sử dụng để hòa tan nó.

4.8  Dung dịch thêm chuẩn DON

Dùng pipet lấy một lượng dung dịch gốc DON (4.7) đã hiệu chuẩn, tương đương 500 μg DON, cho vào bình định mức 5 ml (5.11). Thêm axetonitril (4.1) đến vạch để tạo thành dung dịch thêm chuẩn có nồng độ 100 μg/ml.

4.9  Dung dịch làm việc DON

Dùng pipet lấy dung dịch gốc DON (4.7) pha loãng đã hiệu chuẩn, tương đương 50 μg DON, cho vào bình định mức 5 ml (5.11). Thêm axetonitril (4.1) đến vạch để tạo thành dung dịch làm việc DON có nồng độ 10 μg/ml.

4.10  Dung dịch hiệu chuẩn DON

...

...

...

Bảng 1 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Dung dịch hiệu chuẩn

Dung dịch làm việc (4.9)

μl

Nồng độ DON

ng/ml

1

450

450

...

...

...

375

375

3

300

300

4

225

225

5

...

...

...

150

6

75

75

4.11  Cột làm sạch ái lực miễn nhiễm DON

Các cột ái lực miễn nhiễm (IA) chứa các kháng thể đặc hiệu đối với deoxynivalenol. Cột phải có khả năng giữ được không ít hơn 2 500 ng DON và độ thu hồi không nhỏ hơn 70 % khi dùng 25 ng DON trong 1 ml đến 2 ml nước (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

5  Thiết bị, dụng cụ

Chỉ sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Cân phân tích, có d = 0,001 g dùng để cân mẫu, d = 0,01 mg dùng để chuẩn bị dung dịch gốc DON (4.7).

...

...

...

5.3  Máy lắc phòng thử nghiệm.

5.4  Máy trộn Vortex, hoặc tương đương.

5.5  Máy nghiền (có các sàng khác nhau).

5.6  Máy trộn lắc.

5.7  Bình cầu có nắp vặn, dung tích 250 ml và 500 ml.

5.8  Phễu, có kích thước thích hợp.

5.9  Bộ lọc, cellulose cỡ lỗ 30 pm.

5.10  Bộ lọc, sợi thủy tinh không chứa chất kết dính, cỡ lỗ khoảng 2 μm.

5.11  Bình định mức, dung tích 2 ml, 5 ml và 10 ml.

...

...

...

5.13  Pipet tự động hoặc xyranh thủy tinh kín khí có thể điều chỉnh được, dung tích 100 μl và 1 000 μl.

5.14  Hệ thống HPLC bao gồm:

5.14.1  Bơm, có khả năng tạo ra gradient nhị phân, không xung, với tốc độ dòng thích hợp cho cột phân tích.

5.14.2  Cột phân tích

Tất cả các cột có thể tách deoxynivalenol ra khỏi các thành phần gây nhiễu khác là thích hợp. Ví dụ: Cột Phenomenex ODS3-Prodigy (kích thước đường kính trong 15 cm x 4,6 mm), cỡ hạt 5 μm, cỡ lỗ 100 Å, cột Octadecylsilan (ODS) kích thước đường kính trong 250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt 3 μm, cỡ lỗ 80 Å, cột Octadecyl (C18) kích thước đường kính trong 250 x 4,6 mm, cỡ hạt 5 μm, cỡ lỗ 180 Å.

5.14.3  Tiền cột (tùy chọn), thích hợp dùng cho cột phân tích được sử dụng.

5.14.4  Bộ lấy mẫu tự động, có khả năng bơm các thể tích thích hợp với độ lặp lại đảm bảo.

5.14.5  Detector UV, có khả năng đo ở bước sóng 220 nm.

5.14.6  Hệ thống thu thập dữ liệu.

...

...

...

5.16  Bình chứa, có kích thước thích hợp với các khớp nối khít với các cột ái lực miễn nhiễm.

5.17  Lọ thủy tinh, có kích thước thích hợp dùng cho bộ lấy mẫu tự động (5.14.4) nhưng với dung tích tối thiểu là 2,0 ml.

5.18  Bộ lọc dạng xyranh, polyamid (nylon) có cỡ lỗ 0,45 pm.

5.19  Bộ cô quay, có khả năng duy trì 50 °C với dòng không khí hoặc khí nitơ ổn định.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Các mẫu cần được lấy và chuẩn bị theo quy định hiện hành nếu có [2], Các mẫu phải được nghiền mịn và trộn kỹ bằng máy nghiền (5.5) và máy trộn (5.6) hoặc bằng cách khác để đồng nhất hoàn toàn trước khi lấy phần mẫu thử để phân tích.

Trong tất cả các trường hợp, nếu mẫu đông lạnh thì cần để mẫu rã đông hoàn toàn trước khi lấy mẫu. Trộn kỹ trước khi lấy phần mẫu thử để phân tích.

6.2  Chiết

...

...

...

Chuẩn bị một phễu (5.8) với giấy lọc (5.9). Lọc mẫu đã chiết vào bình sạch có nắp vặn dung tích 250 ml hoặc 500 ml (5.7).

6.3  Làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm

Lắp bình chứa (5.16) vào cột ái lực miễn nhiễm (4.11). Thêm 8 ml nước đã loại ion. Sau đó chuyển 2,0 ml dịch đã chiết lọc (xem ở trên; 0,5 ml nếu kết quả phân tích trên 4 000 μg/kg, xem Điều 8) vào bình chứa (5.16). Để dung dịch này chảy chậm tự nhiên qua cột ở tốc độ 1 giọt/s đến 2 giọt/s. Khi dịch chiết chảy hết qua cột ái lực miễn nhiễm, cho 5 ml nước đã loại ion chảy qua cột. Loại bỏ chất lỏng còn lại bằng cách cho khí nitơ hoặc không khí đi qua cột trong khoảng 5 s. Loại bỏ tất cả các dịch rửa giải của bước làm sạch này.

Cuối cùng, đặt lọ lấy mẫu tự động HPLC (5.17) dưới cột và cho 0,5 ml metanol (4.3) chảy tự nhiên qua cột để thu dịch rửa giải. Sau khi các giọt metanol cuối cùng đi qua cột khoảng 1 min, thêm 1,0 ml metanol (4,3) khác và tiếp tục thu lấy dịch rửa giải, cẩn thận cho khí nitơ hoặc không khí qua cột để thu lấy tất cả dịch rửa giải còn lại.

CHÚ THÍCH: Ngoài cách tiến hành thủ công (6.4) thì việc làm sạch và rửa giải cột ái lực miễn nhiễm có thể được thực hiện với bộ chuẩn bị mẫu tự động, với điều kiện thể tích và tốc độ dòng không đổi.

6.4  Chuẩn bị dung dịch thử để phân tích HPLC

Đặt lọ có chứa dịch rửa giải trong bộ cô quay (5.19) và cẩn thận để bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ hoặc không khí ở nhiệt độ khoảng 50 °C. Ngay sau đó, làm nguội lọ HPLC đến nhiệt độ môi trường và pha loãng lại phần cặn bằng 0,50 ml pha động HPLC (4.5). Trộn đều bằng máy trộn Votex (5.4) trong ít nhất 30 s để đảm bảo lượng cặn được hòa tan hết. Trong trường hợp dịch lọc bị vẩn đục thì lọc dung dịch thử qua bộ lọc dạng xyranh (5.18).

6.5  Quy trình thêm chuẩn

Để xác định độ thu hồi thêm chuẩn cho vật liệu không chứa deoxynivalenol cùng các dung dịch thêm chuẩn (4.8). Mức thêm chuẩn phải trong dải hiệu chuẩn (tốt nhất là giữa dải). Để yên mẫu thêm chuẩn ít nhất 30 min để đảm bảo dung môi bay hơi.

...

...

...

7.1  Đường chuẩn

Dựng đường chuẩn vào đầu mỗi ngày phân tích bằng cách bơm các dung dịch hiệu chuẩn (4.10) ở các nồng độ thích hợp khác nhau vào máy sắc ký. Dựng đường chuẩn trước khi phân tích mẫu thử bằng cách dựng đồ thị nồng độ DON (ng/ml) (trục X) dựa theo tín hiệu pic như diện tích pic hoặc chiều cao pic (trục Y), xác định độ dốc và phần bị chặn bằng hồi quy tuyến tính và kiểm tra đồ thị để sử dụng chẩn đoán thích hợp.

7.2  Xác định deoxynivalenol trong dung dịch thử

Bơm các lượng dung dịch thử vào máy sắc ký, sử dụng cùng điều kiện đã dùng để dựng đường chuẩn.

7.3  Nhận biết pic

Nhận biết pic deoxynivalenol trong dung dịch thử bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu của dung dịch hiệu chuẩn HPLC (4.10) gần nhất được bơm vào mẻ phân tích HPLC. Nồng độ deoxynivalenol trong dung dịch thử phải nằm trong dải hiệu chuẩn. Nếu nồng độ deoxynivalenol trong dung dịch thử vượt quá nồng độ dung dịch hiệu chuẩn cao nhất thì phải pha loãng dung dịch thử bằng pha động HPLC để đưa nồng độ deoxynivalenol nằm trong dải hiệu chuẩn và phân tích lại. Hệ số pha loãng phải được đưa vào tất cả các tính toán tiếp theo.

7.4  Điều kiện hoạt động HPLC

Sử dụng thiết bị nêu trong 5.14 với các điều kiện dưới đây cho thấy tách tốt:

Thể tích bơm: 100 μl đến 300 μl

...

...

...

Tốc độ dòng pha động (cột); 1,0 ml/min

Nếu máy bơm HPLC chuyển pha động (4.5) qua kênh A và dung môi rửa (4.6) qua kênh B thì quy trình gradient như sau:

Thời gian (min)

Kênh A (%)

Kênh B (%)

Từ 0 đến 15

100

0

Từ 15 đến 25

...

...

...

100

Từ 25 đến 35

100

0

CHÚ THÍCH: Pha động được chuẩn bị bằng axetonitril và nước cũng đã được chứng minh là các lựa chọn thay thế thích hợp. Các pha động như vậy có thể được sử dụng khi đã đạt được hiệu quả tách tốt.

8  Tính kết quả

Xác định từ đường chuẩn nồng độ khối lượng deoxynivalenol, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml), có trong dung dịch thử được bơm vào cột HPLC.

Tính phần khối lượng của deoxynivalenol, w_DON, bằng nanogam trên gam (ng/g) hoặc microgam trên kilogam (μg/kg), lấy kết quả đến một số thập phân, sử dụng Công thức (3):

...

...

...

Trong đó:

c_DON là nồng độ khối lượng của deoxynivalenol được xác định trong quá trình hiệu chuẩn (7.1);

V₃ là tổng thể tích của dung dịch thử (0,5 ml, 6.4);

V₂ là thể tích của dịch chiết được dùng để làm sạch (2,0 ml hoặc 0,5 ml, 6.3);

V₁ là tổng thể tích dung môi chiết (200 ml, 6.2);

m_s là khối lượng của phần mẫu thử chiết được (m_s = 25,0 g, 6.2);

Công thức tính trên có thể được rút gọn nếu sử dụng khối lượng hoặc thể tích quy định:

w_DON = c_DON x 2 (2 ml dịch chiết đã được làm sạch)

(4)

...

...

...

W_DON= C_DON x 8 (0,5 ml dịch chiết đã được làm sạch)

(5)

9  Độ chụm

9.1  Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Chi tiết nghiên cứu liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Tài liệu tham khảo [1], Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và /hoặc nền mẫu khác với các dải nồng độ và/hoặc nền mẫu đã nêu.

9.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

 = 229 μg/kg

r = 87,5 μg/kg

...

...

...

r = 97,2 μg/kg

 = 188 μg/kg

r = 31,9 μg/kg

 = 505 μg/kg

r = 233,2 μg/kg

 =1 013 μg/kg

r = 232,9 μg/kg

9.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, được báo cáo bời hai phòng thử nghiệm, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

...

...

...

R = 100,6 μg/kg

 = 401 μg/kg

R = 184,7 μg/kg

 = 188 μg/kg

R = 132,8 μg/kg

 = 505 μg/kg

R = 329,2 μg/kg

 =1 013 μg/kg

R = 299,0 μg/kg

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và kiểu quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị;

g) hoặc độ lặp lại đã được xác nhận;

h) điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu độ chụm

Các dữ liệu dưới đây thu được trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm [3] phù hợp với Hướng dẫn của AOAC về các quy trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá, xác nhận các đặc tính của phương pháp phân tích [4].

Bảng A.1 - Các kết quả thu được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Mẫu

Thức ăn chăn nuôi

Thức ăn chăn nuôi

...

...

...

Thức ăn chăn nuôi

Thức ăn chăn nuôi

Thức ăn chăn nuôi

Năm thử nghiệm liên phòng

2005

2005

2005

2005

2005

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm

11

11

13

13

13

12

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

10

...

...

...

12

11

13

12

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

1

1

1

2

...

...

...

0

Số lượng các kết quả được chấp nhận

10

10

12

11

13

12

Giá trị trung bình , μg/kg

...

...

...

401

< 30

188

505

1 013

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, μg/kg

31,2

34,7

n.a.^c

...

...

...

83,3

83,2

Hệ số biến thiên lặp lại, CV(r), %

13,7

8,7

n.a.^c

6,1

16,5

8,2

...

...

...

87,5

97,2

n.a.^c

31,9

233,2

232,9

Độ lệch chuẩn tái lập s_R, μg/kg

35,9

66,0

...

...

...

47,4

117,6

106,8

Hệ số biến thiên tái lập, CV(R), %

15,7

16,5

n.a.^c

25,2

23,3

...

...

...

Giá trị horat

0,8

0,9

n.a.^c

1,2

1,3

0,7

Giới hạn tái lập, R ^b, μg/l

100,6

...

...

...

n.a.^c

132,8

329,2

299,0

Độ thu hồi, %

100

93

n.a.^c

n.a.^c

...

...

...

n.a.^c

^a - r = 2,8 x s_r

^b - R = 2,8 x s_R

^c - không áp dụng

Bảng A.2 - Thành phần nguyên liệu

Vật liệu thử

Thành phần

Khối lượng

(kg)

...

...

...

Mẫu trắng

Yến mạch (đã bỏ vỏ)

1,5

Yến mạch

Yến mạch (đen)

1,5

Yến mạch

Hạt đậu tương

1,5

...

...

...

Thức ăn cho thỏ

1,5

Hỗn hợp ngũ cốc, cà rốt

Hỗn hợp thức ăn cho chim

3

Hạt hướng dương, ngô, yến mạch, lúa mì, hạt dại, hạt cải dầu

Mức 1

Thức ăn hỗn hợp cho lợn

8

...

...

...

Mức 2

Thức ăn hỗn hợp cho ngựa

8

Mảnh lúa mạch, mảnh yến mạch, mảnh ngô, dầu thực vật, cỏ alfalfa, viên nén hỗn hợp dùng cho ngựa

Mức 3

Thức ăn cho ngựa

2

Yến mạch, mảnh lúa mạch, mảnh ngô, đậu Hà Lan, mật mía, dầu thực vật

Thức ăn cho thỏ

...

...

...

Lúa mì, cỏ alfalfa, hạt hướng dương, hạt bắp cải, rỉ rơm, lúa mạch, đậu nành rang

Thức ăn hỗn hợp cho lợn

4

Đậu Hà Lan, lúa mì, lúa mạch, sắn, hạt bắp cải, mỡ động vật, ngô, canxi cacbonat

Cỏ ngọt cho ngựa

0,5

Thành phần chưa biết cùng với cà rốt và vitamin A, D₃ và E

Cỏ alfalfa

1

...

...

...

Lúa mì

0.7

Lúa mỳ

Hỗn hợp đậu tương/ngô

2

Đậu tương/ngô, tỷ lệ mỗi loại 50 %

Phụ lục B

(Tham khảo)

...

...

...

Hình B.1 - Mẫu thức ăn chăn nuôi bị nhiễm tự nhiên ở nồng độ khoảng 2 mg/kg

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Krska, R., et al., Determination of molar absorptivity coefficients for major type-B trichothecenes and certification of calibrators for deoxynivalenol and nivalenol. Anal Bioanal Chem, 2007. 388(5-6): p. 1215-1226

[2] EC, COMMISSION REGULATION (EC) No 401/2006 of 23 February 2006 laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs. Official Journal of the European Union, 2006. 49(L70): p. 12-34

[3] Stroka, J., et al., Liquid Chromatographic Determination of Deoxynivalenol in Baby Food and Animal Feed: Interlaboratory study. J AOAC Int, 2006. 89(4): p. 1012-1020

[4] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, p. 23-51

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12431:2018 (EN 15791:2009) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng Deoxynivalenol - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng Detector UV với làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm