7.2  Giám định bằng ELISA

Thực hiện theo điều 7.1.2 của TCVN 12371-1: 2019

Sử dụng các loại dịch mẫu đã nêu trong điều 7.1.2.2 của TCVN 12371-1:2019 ngoài ra có thể sử dụng dịch mẫu tách chiết từ hạt như điều 7.1.1 phần tách chiết vi khuẩn từ hạt.

7.3  Giám định bằng PCR

Thực hiện theo điều 7.1.3 của TCVN 12371-1: 2019

Sử dụng một trong những cặp mồi đặc hiệu:

- Cặp mồi 1 (AGES, AT)

PST-1: 5’ CCT CAC ACC ATC GGA TGT G -3’

PST-R: 5’ ATG AGG TTA TTA ACC TCA CCA- 3’

...

...

...

95 °C trong 5 phút

94 °C trong 30 giây

Lặp lại 30 chu kì

58 °C trong 30 giây

72 °C trong 30 giây

72 °C trong 7 phút

Đọc kết quả

...

...

...

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 263 bp.

Cặp mồi 2 (Coplin & Majerczak (2002))

ES16-1: 5’GCG AAC TTG GCA GAG AT -3’

ESIG2c-R: 5' GCG CTT GCG TGT TAT GAG- 3’

Với chu trình nhiệt:

95 °C trong 4 phút

94 °C trong 30 giây

Lặp lại 30 chu kì

...

...

...

72 °C trong 45 giây

72 °C trong 7 phút

Đọc kết quả

Sản phẩm được điện di bằng gel agarose 1,5 % (4.2).

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 920 bp.

7.4  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert khi:

- Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng PCR

...

...

...

- Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng ELISA

hoặc

- Vi khuẩn có đặc điểm sinh hóa phù hợp với đặc điểm sinh hóa được mô tả tại điều 7.1.3.10

7  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

- Kết quả giám định: Tên khoa học của loài

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh vi khuẩn héo rũ ngô

Tên khoa học: Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

Tên khác:

Aplanobacter stewartii (Smith) McCulloch

...

...

...

Bacterium stewartii (Smith) Smith

Erwinia stewartii (Smith) Dye

Pantoea stewartii subsp. stewadii (Smith) Mergaert et al.

Phytomonas stewartii (Smith) Bergey et al.

Pseudobacterium stewartii (Smith) Krasil'nikov

Pseudomonas stewartii Smith

Xanthomonas stewartii (Smith) Dowson

Vị trí phân loại:

Bộ: Enterobacteriales

...

...

...

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á: Korea; Châu Mỹ: USA, Canada, Costa Rica, Puerto Rico, Trinidad and Tobago, Argentina, Bolivia, Brazil, Guyana, Paraguay, Peru; Châu Âu: Switzeland

A.3  Ký chủ

Zea mays (ngô), Zea mays subsp. mays (ngô ngọt), Zea mays subsp. mexicana, Zea mays subsp. parviglumis

Agrostis gigantea, Coix lacryma-jobi, Dactylis glomerata, Digitaria, Dracaena sanderiana, Panicum capillare, Panicum dichotomiflorum, Poa pratensis, Set aria lutescens, Sorghum sudanense, Tripsacum dactyloides, Triticum aestivum (lúa mì)

A.4  Đặc điểm sinh học

P. stewartii tồn tại trong mô sống của cây và hạt. Khả năng truyền qua hạt của vi khuẩn liên quan chặt chẽ tới mức độ gây hại của bệnh trên cây sản xuất hạt giống và cũng liên quan tới mức độ cảm nhiễm hay kháng của cây bố mẹ.

Sự thay đổi về giải phẫu học khi bệnh phát triển trong tế bao đã được nghiên cứu trên các giống ngô nhiễm và chống chịu bệnh sử dụng ánh sáng và kính hiển vi điện tử. Khi lá của cây ở giai đoạn trổ cờ được lây nhiễm vi khuẩn này, vết bệnh trên các giống nhiễm phát triển nhanh gấp 3 đến 4 lần giống kháng. Màng ngăn giữa các tế bào bó mạch bị bao phủ bởi các vật chất tương tự như exopolysaccharide của vi khuẩn khi mật độ vi khuẩn trong mạch dẫn vẫn còn rất thấp. Bó mạch bị bít tắc hoàn toàn bằng tế bào vi khuẩn và exopolysaccharide khi mật độ vi khuẩn tăng cao. Khả năng sản sinh exopolysaccharide và độc tính có quan hệ với nhau. Khả năng thủy phân polysaccharide vỏ và độc tính của P. stewartii chịu tác động của giao tiếp sinh học thông qua phân tử tín hiệu (quorum-sensing regulatory proteins). Chất làm dính (agglutinin) vi khuẩn đã được chiết xuất từ các hạt ngô trên mặt đất cà phản ứng của chất này đã được thử nghiệm với 22 dòng vi khuẩn có độc tính khác nhau. Khả năng ngưng kết đặc hiệu (Specific agglutination) tỷ lệ nghịch với độc tính của vi khuẩn. Dòng độc của vi khuẩn đã được nghiên cứu rất kĩ về mặt sinh học phân tử. Một nhóm gen độc 24kb của vi khuẩn cần thiết để tạo ra hiện tượng đốm sũng nước và héo cây con nhưng cụm gen này không bắt buộc cho sự phát triển ban đầu của vi khuẩn.

...

...

...

Phụ lục B

(Quy định)

Dung dịch và Môi trường

B.1  Đệm phosphat

Thành phần:

Na₂HPO₄ (4.3)        4,26 g

KH₂PO₄ (4.4)         2,72 g

Nước cất (4.5)       1 000 ml

...

...

...

Điều chỉnh pH của môi trường về pH 7,4

B.2  Môi trường thử khả năng di động của vi khuẩn

Thành phần

Chất chiết nấm men (4.6)

3g

Peptone (4.7)

5 g

Agar (4.8)

2,5 g

...

...

...

1 000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần trên vào nước cất (4.5).

Điều chỉnh pH của môi trường về pH 7,2

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.3  Môi trường Voges- Proskauer

Thành phần

Peptone (4.7)

5g

...

...

...

5g

Glucose (4.10)

5 g

Nước cất (4.5)

1 000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần trên vào nước cất (4.5), chỉnh pH 7,5.

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.4  Thuốc thử Methyl red

...

...

...

Methyl red (4.11)             0,1 g

Ethanol 95% (4.12)          300 ml

Hòa tan hoàn toàn các thành phần thêm nước cất (4.5) cho đủ dung tích 500 ml

B.5  Môi trường thừ idole

Thành phần

Tryptone (4.13)

10 g

L-trytophan (4.14)

1 g

...

...

...

1 000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần vào nước cất (4.5), chỉnh pH từ 7,2 đến 7,4.

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.6  Thuốc thử Kovacs

Hòa tan 5 g p-dimethylaminobenzaldehyde (4.15) trong 75 ml 1 pentanol (4.16) trong bể ổn nhiệt. Để nguội và thêm vào 25 ml HCI 35 % (4.17).

B.7  Môi trường Nitrate

Thành phần

Peptone (4.7)

...

...

...

Chất chiết nấm men (4.6)

1 g

K₂HPO₄(4.4)

5 g

KNO₃ (4.18)

1 g

Agar (4.8)

3g

Nước cất (4.5)

...

...

...

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần vào nước cất (4.5), chỉnh pH 7,2

Chia vào mỗi ống nghiệm (3.5) 10 ml môi trường.

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.8  Thuốc thử nitrate

Dung dịch A: hòa tan 1,6 g sunphanilic acid (4.19) trong 60 ml axit acetic băng (4.20) và 140 nước cất (4.5) trong bể ổn nhiệt.

Dung dịch B: hòa tan 0,2 g 8-amino-2-napthlenesulfonic acid (4.21) trong 120 ml nước cất (4.5) trong bể ổn nhiệt. Sau đó thêm vào 30 ml axit acetic băng (4.20).

B. 9  Môi trường phân giải Aesculin

Thành phần

...

...

...

10 g

Aesculin (4.22)

1 g

Sắt citrat (4.23)

50 mg

Natri citrat (4.24)

1 g

Nước cất (4.5)

1 000 ml

...

...

...

Hòa tan các thành phần vào nước cất (4.5), chỉnh pH 7,2

Chia vào mỗi ống nghiệm (3.5) 10 ml môi trường.

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.10  Môi trường thủy phân

Thành phần

(NH₄)H₂PO₄ (4.25)

1 g

KCI (4.26)

0,2 g

...

...

...

0,2 g

Peptone (4.7)

1 g

Bromothymol blue (4.28)

0,03 g

Agar (4.8)

3g

Nước cất (4.5)

1 000 ml

...

...

...

+ Dung dịch môi trường: Hòa tan hoàn toàn các thành phần (trừ Agar (4.8) và Bromothymol blue (4.28)) vào nước cất (4.5), chỉnh pH 7 đến 7,2. Thêm Agar (4.8) và Bromothymol blue (4.28) đun tới khi hòa tan hoàn toàn. Sau đó, hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút. Môi trường thu được có màu xanh lá cây đến xanh lam.

+ Môi trường thủy phân: Nhỏ 5 ml dung dịch Arbutin 10 % (4.29), Maltose 10 % (4.30), Salicin 10% (4.31), Raffinose 10% (4.32) đã vô trùng vào dung dịch môi trường chia vào các ống nghiệm (3.5) vô trùng

B.11  Môi trường phân giải Malonate

Thành phần

Natri malonat (4.33)

3g

(NH₄)₂SO₄ (4.34)

2g

NaCI (4.35)

...

...

...

Chất chiết nấm men (4.6)

1 g

K₂HPO₄ (4.4)

0,6 g

KH₂PO₄ (4.9)

0,4 g

Dextrose (4.36)

0,25 mg

Bromothymol blue (4.28)

...

...

...

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần vào nước cất (4.5), chỉnh pH 6,7

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan giám định

.............................

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
---------------

...

...

...

……… ngày …… tháng…… năm 20…

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                             Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

...

...

...

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12371-2-5:2020. Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

13. Kết quả giám định:

Tên tiếng Việt: Bệnh vi khuẩn héo rũ ngô

Tên khoa học: Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

Tên khác:

...

...

...

Bacillus stewartii (Smith) Holland

Bacterium stewartii (Smith) Smith

Erwinia stewartii (Smith) Dye

Pantoea stewartii subsp. stewartii (Smith) Mergaert et al.

Phytomonas stewartii (Smith) Bergey et al.

Pseudobacterium stewartii (Smith) Krasil’nikov

Pseudomonas stewartii Smith

Xanthomonas stewartli (Smith) Dowson

Vị trí phân loại:

...

...

...

Họ: Enterobacteriaceae

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT
(hoặc người giám định)
(ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ
(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Bradbury J. F (1986), Guide to Plant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom.

[2] CABI (2017), Crop Protection Compedium.

[3] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

...

...

...

[5] TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.

[6] Viện Bảo vệ thực vật (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-5:2020 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert