TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12371-2-16:2024

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY HẠI THỰC VẬT

PHẦN 2-16: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS KHẢM LÁ SẮN SRI LANKA (SRI LANKAN CASSAVA MOSAIC VIRUS - SLCMV)

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma

Part 2-16: Particular requirements for Sri Lankan cassava mosaic virus (SLCMV)

Lời nói đầu

TCVN 12371-2-16:2024 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Ủy ban Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

...

...

...

- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus

- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus

- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Potato spindle tuber viroid

- TCVN 12371-2-7:2021: Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với Coffee ringspot virus

- TCVN 12371-2-8:2021: Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. garcae

- TCVN 12372-2-9:2021: Phần 2-9: Yêu cầu cụ thể đối với Rice grassy stunt virus và Rice ragged stunt virus

...

...

...

- TCVN 12371-2-11:2022: Phan 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối do Banana bunchy top virus

- TCVN 12371-2-12:2022: Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY HẠI THỰC VẬT

PHẦN 2-16: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS KHẢM LÁ SẮN SRI LANKA (SRI LANKAN CASSAVA MOSAIC VIRUS - SLCMV)

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma

Part 2-16: Particular requirements for Sri Lankan cassava mosaic virus (SLCMV)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus khảm lá sắn Sri Lanka (SLCMV) gây bệnh khảm lá sắn trên mẫu chồi, lá, mầm của cây sắn và trên bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci.

...

...

...

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12371-1:2019. Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.

3  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng giám định (theo điều 3 của TCVN 12371-1:2019) và các thiết bị, dụng cụ sau:

3.1  Bể ủ nhiệt, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C

3.2  Hệ thống đọc bản gel UV thông thường

3.3  Máy chu trình nhiệt (PCR), cho phép thể tích mẫu 10 ~ 100 μl.

3.4  Máy đảo mẫu (máy vortex), tốc độ lắc đạt 1 000 r/min, lắc tròn

3.5  Máy điện di, có công suất tới 150W, điện áp tới 300V và dòng tới 700mA

...

...

...

3.7  Máy real-time PCR, cho phép thể tích mẫu 10 ~ 100 μl.

3.8  Máy ủ nhiệt khô, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C

3.9  Ống eppendorf, có thể tích 1,5 ml

3.10  Ống hút côn trùng

3.11  Pipet, có dung tích danh định 10 ml, 1 ml, 0,1 ml, 0,01 ml; sử dụng đầu tip vô trùng

3.12  Que nghiền côn trùng chuyên dụng

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác. Hóa chất sử dụng theo điều 4 của TCVN 12371-1:2019 và các hóa chất dưới đây. Phương pháp pha các loại dung dịch tham khảo phụ lục B.

4.1  Agarose: nồng độ 1,5%

...

...

...

4.3  Axit boric (H₃BO₃): tinh thể

4.4  Axit Clohidric (HCl): nồng độ 37%

4.5  Cặp mồi đặc hiệu cho SLCMV để giám định bằng phương pháp PCR thông thường

SLCMV-F2: 5'- TGT GAA GGC CCA TGT AAG GT -3'

SLCMV-R3: 5'- CGT AGC GTA TAC AGG RTT AGA -3'

4.6  Cặp mồi đặc hiệu cho SLCMV để giám định bằng phương pháp Real-time PCR

SqPCR-1 F: 5'- ACT TGA CGT CTG AGC TGG-3'

SqPCR-1R: 5'- GAA CCT CAC CTC CAT GCT -3’

4.7  Cồn (C₂H₅OH) tuyệt đối: 99,7%

...

...

...

4.9  Ethylenediaminetetraacetic Axit (EDTA) (C₁₀H₁₆N₂O₈): tinh thể

4.10  Mẫu dò (Probe)

Probe (Taqman) qPCR-F: 5'-FAM-TGT TGG GGT GGA AAC TGG TG CT-BHQ1-3’

4.11  Mẫu đối chứng âm

4.12  Mẫu đối chứng dương

4.13  Mẫu trắng

4.14  Natri hydroxide (NaOH): tinh thể

4.15  Nước cất

4.16  Thuốc nhuộm axit nucleic

...

...

...

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

Mẫu thực vật (chồi, lá, mầm): lá thật (fully expanded leaf) thứ 01 hoặc 02 tính từ chồi ngọn của cây sắn được chọn để lấy mẫu. Chồi hoặc mầm được lấy từ hom sắn. Xử lý mẫu thực vật sau khi được lấy theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019.

Mẫu bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci: Bọ phấn trưởng thành được thu bằng ống hút côn trùng (3.10) và được ngâm trong cồn tuyệt đối (4.7), bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thường trong quá trình thu mẫu và vận chuyển.

5.2  Bảo quản mẫu

Mẫu chồi, mầm và lá: bảo quản và vận chuyển mẫu về phòng giám định theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12371-1:2019.

Mẫu bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci: ngâm trong cồn tuyệt đối (4.7) và bảo quản ở điều kiện -20 °C đến khi thực hiện giám định.

6 Triệu chứng điển hình của bệnh

Triệu chứng điển hình của bệnh khảm lá sắn trên các giống mẫn cảm bao gồm: khảm màu xanh vàng loang lổ trên lá, phiến lá gồ ghề, lá bị biến dạng, cây thấp lùn, sinh trưởng chậm. Trên các giống chống chịu hoặc giống kháng, triệu chứng bệnh chỉ biểu hiện trên lá với những vệt màu vàng nhạt, lá không biến dạng, cây phát triển bình thường. Các triệu chứng có thể thay đổi khác nhau từ lá này sang lá khác, từ cây này sang cây khác, thậm chí trên cùng một giống sắn trồng cùng một ruộng. Sự thay đổi về triệu chứng có thể do sự khác biệt về chủng virus, giống sắn, tuổi cây và các yếu tố môi trường như mức độ dinh dưỡng, độ ẩm của đất và đặc biệt là nhiệt độ.

...

...

...

7  Giám định virus gây bệnh

7.1  Giám định bằng phương pháp PCR thông thường

7.1.1  Tách chiết DNA

Mẫu chồi, lá, mầm: thực hiện tách chiết mẫu lá nghi nhiễm bệnh theo điều 7.1.3.2 của TCVN 12371-1:2019

Mẫu bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci: tách chiết bằng phương pháp sử dụng NaOH 50 mM (B.5) và Tris-HCl 1 M (B.6) (quy trình tách chiết chi tiết xem phụ lục C)

7.1.2  Khuếch đại gen

DNA thu được sau khi tách chiết tiến hành khuếch đại đoạn gen mong muốn trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.3).

Mẫu đối chứng dương (mẫu cây nhiễm SLCMV) (4.12), mẫu đối chứng âm (mẫu cây không nhiễm SLCMV) (4.11) và mẫu trắng (mẫu nước sử dụng để chuẩn bị phản ứng PCR) (4.13) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để giám định SLCMV (4.5).

...

...

...

95 °C trong 5 phút

Lặp lại 30 chu kì

95 °C trong 30 giây

53 °C trong 30 giây

72 °C trong 60 giây

72 °C trong 10 phút

* Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm sử dụng của từng nhà sản xuất.

7.1.3  Đọc kết quả

Sản phẩm PCR được trộn với dung dịch đệm nhuộm điện di (4.8), sau đó điện di bằng máy điện di (3.5) sử dụng gel agarose 1,5 % (4.1) đã có sẵn thuốc nhuộm axit nucleic (4.16) trong dung dịch đệm điện di TAE (B.1) hoặc TBE (B.2) với thời gian 30 phút ở hiệu điện thế 110 V.

...

...

...

Các loại mẫu đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Mẫu đối chứng dương: xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~ 520 bp.

+ Mẫu đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện vạch trên bản gel

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu giám định cho kết quả dương tính (nhiễm virus) khi xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~ 520 bp.

+ Mẫu giám định cho kết quả âm tính (không nhiễm virus) khi không xuất hiện vạch trên bản gel.

+ Thực hiện giám định lại nếu mẫu giám định cho kết quả PCR không rõ ràng.

7.2  Giám định bằng phương pháp Real-time PCR

7.2.1  Tách chiết DNA

...

...

...

Mẫu bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci: tách chiết bằng phương pháp sử dụng NaOH 50 mM (B.5) và Tris-HCl 1 M (B.6) (quy trình tách chiết chi tiết xem phụ lục C)

7.2.2  Phản ứng Real-time PCR

DNA thu được sau khi tách chiết tiến hành phản ứng Real-time PCR trong máy Real-time PCR (3.7).

Mẫu đối chứng dương (mẫu cây nhiễm SLCMV) (4.12), mẫu đối chứng âm (mẫu cây không nhiễm SLCMV) (4.11) và mẫu trắng (mẫu nước sử dụng để chuẩn bị phản ứng PCR) (4.13) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (4.6) và mẫu dò (Probe) (4.10):

Phản ứng Realtime PCR được thực hiện ở điều kiện:

95 °C trong 3 phút

Lặp lại 40 chu kỳ

95 °C trong 15 giây

...

...

...

* Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm sử dụng của từng nhà sản xuất.

7.2.3  Đọc kết quả

Kết quả phản ứng Real-time PCR được hiển thị trên màn hình máy Real-time PCR (3.7).

Các loại mẫu đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện như sau:

+ Mẫu đối chứng dương: xuất hiện đường chuẩn khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 35.

+ Mẫu đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện đường chuẩn khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct).

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu giám định cho kết quả dương tính (nhiễm virus) khi xuất hiện đường chuẩn khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 35.

+ Mẫu giám định cho kết quả âm tính (không nhiễm virus) khi không xuất hiện đường chuẩn khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct = 0.

...

...

...

7.3  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là nhiễm virus khảm lá sắn Sri Lanka (SLCMV) khi:

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng PCR thông thường

Hoặc

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng Real-time PCR.

8  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

Thông tin về mẫu giám định

Tên loài

...

...

...

Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu kết quả giám định xem phụ lục D.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Virus khảm lá sắn Sri Lanka

Tên khoa học: Sri Lankan cassava mosaic virus

...

...

...

Bộ: Geplafuvirales

Họ: Geminiviridae

Chi: Begomovirus

A.2  Phân bố

Châu Á: Ấn Độ, Cam-pu-chia, Lào, Sri Lanka, Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam.

A.3  Ký chủ chính

Sắn (Manihot esculenta), Cọc rào (Jatropha curcas).

A.4  Đặc điểm sinh học

SLCMV được lan truyền bằng 02 phương thức chính là qua hom giống nhiễm bệnh và qua môi giới là loài bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci (bộ Hemiptera: họ Aleyrodidae) (Uke và cs., 2018; Trịnh Xuân Hoạt và cs., 2021). Phương thức lan truyền thông qua vật liệu giống nhiễm bệnh giúp virus có thể phân tán đi khoảng cách địa lý xa, tỷ lệ nhiễm virus trên cây con trồng bằng hom nhiễm bệnh có thể lên đến 100% ngay sau khi cây nảy mầm. Trong khi đó, bọ phấn trắng thuốc lá giúp virus lây lan trong khoảng cách địa lý ngắn hơn, giữa những ruộng sắn trong vùng trồng và giữa các cây trong cùng một ruộng [5].

...

...

...

Hình 1 - Triệu chứng của bệnh khảm lá sắn trên giống sắn mẫn cảm [1]

Hình 2 - Triệu chứng của bệnh khảm lá sắn trên giống sắn kháng bệnh HN5 [Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I]

Hình 3 - Cây sắn nhiễm bệnh khảm lá do trồng từ hom sắn bị nhiễm bệnh [Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I]

Hình 4 - Cây sắn nhiễm bệnh khảm lá do môi giới truyền virus từ cây nhiễm bệnh sang cây khỏe [Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I]

Phụ lục B

(Quy định)

...

...

...

B.1  Dung dịch đệm điện di TAE

0,5 M EDTA (B.3)

2 ml

Tris-Base (4.17)

4,84 g

Axit acetic (4.2)

1,15 ml

Nước cất (4.15)

1000 ml

...

...

...

B.2  Dung dịch đệm điện di TBE

0,5 M EDTA (B.3)

4 ml

Tris-Base (4.17)

10,8 g

Axit boric (4.3)

5,5 g

Nước cất (4.15)

1000 ml

...

...

...

B.3  Dung dịch 0,5 M EDTA (pH 8)

EDTA (4.9)

18,61 g

Nước cất (4.15)

100 ml

Hoà tan lượng EDTA trong 80 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 1M (B.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.4  Dung dịch 1M NaOH

NaOH (4.14)

4 g

...

...

...

100 ml

Hoà tan lượng NaOH trên trong 80 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.5  Dung dịch 50 mM NaOH

NaOH 1 M (B.4)

5 ml

Nước cất (4.15)

95 ml

Hoà 5 ml dung dịch NaOH 1 M (B.4) trong 95 ml nước cất trước, khuấy đều. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.6  Dung dịch 1 M Tris-HCl (pH 8)

...

...

...

12,11 g

Nước cất (4.15)

100 ml

Hoà tan lượng Tris-Base (4.17) trong 60 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch axit HCl (4.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp tách chiết DNA của SLCMV từ bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci sử dụng dung dịch 50 mM NaOH và 1 M Tris-HCl

- Cho 01 - 03 cá thể trưởng thành bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci vào ống eppendorf 1,5 ml (3.9).

...

...

...

- Đậy chặt nắp ống Eppendorf chứa dịch nghiền bọ phấn trắng thuốc lá và ủ dịch nghiền bọ phấn trắng thuốc lá trong bể ủ nhiệt (3.1) hoặc máy ủ nhiệt khô (3.8) ở điều kiện nhiệt độ 95 °C trong 5 phút.

- Để nguội dịch nghiền trong 1 - 2 phút, thêm 10 μL dung dịch Tris-HCl (pH 8) (B.6) vào ống Eppendorf chứa dịch nghiền bọ phấn trắng thuốc lá đã ủ.

- Trộn dịch nghiền trong ống Eppendorf bằng máy đảo mẫu (máy vortex) (3.4), làm lắng dịch nghiền bằng máy minispin (3.6) trong 30 giây. Dịch nghiền sau khi làm lắng được sử dụng để thực hiện giám định hoặc có thể bảo quản ở nhiệt độ 4 °C trong 05 ngày trong trường hợp thực hiện giám định sau.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Tổ chức giám định

....................................

...

...

...

………., ngày ... tháng ... năm 20…...

KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH SINH VẬT GÂY HẠI

Kính gửi: ..................................................................................

1. Tên mẫu:

2. Mã số mẫu:

3. Tình trạng mẫu:

4. Ngày nhận mẫu:

...

...

...

TT

Chỉ tiêu giám định

Phương pháp giám định

Kết quả giám định

1

Virus khảm lá sắn Sri Lanka (SLCMV)

TCVN 12371-2-16: 2024

Nhiễm/ không nhiễm

...

...

...

(hoặc người giám định)

(ký, ghi rõ họ và tên)

LÃNH ĐẠO TỔ CHỨC GIÁM ĐỊNH

(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

_____________________________________________________

Ghi chú:

- Kết quả ghi trong phiếu này chỉ có giá trị đối với mẫu giám định tại phòng thí nghiệm.

...

...

...

[1] CABI, 2023. Crop Protection Compendium.

[2] Trịnh Xuân Hoạt, Nguyễn Chí Hiểu, Ngô Quang Huy, Nguyễn Đức Huy (2021). Xác định phương thức lan truyền của Sri Lankan cassava mosaic virus (SLCMV) gây bệnh khảm lá sắn ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 19(2): 206-214.

[3] Trịnh Xuân Hoạt, Dương Thị Nguyên và Lê Quang Mẫn (2001). Một số nghiên cứu về xác định Biotype của bọ phấn trắng thuốc lá Bemisia tabaci truyền vi-rút khảm lá sắn tại Việt Nam. Tạp chí BVTV - Số 1/2021.

[4] Trương Thị Huỳnh Như, Huỳnh Thị Ngọc Mai, Lê Hồng Kông, Trần Trung Chánh, Phạm Thị Nhạn, Lê Khanh, Phạm Quốc An, Nguyễn Hữu Hoàng (2022). Bước đầu nghiên cứu sự hiện diện của Sri Lankan cassava mosaic virus (SLCMV) trên sắn (Manihot esculenta Crantz 1766). HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 17(2), 5-20.

[5] Ayaka Uke, Sophary Khin, Kengo Kitaura, Masashi Ugaki and Keiko T. Natsuaki, 2019. Combination of an image-posting system and molecular diagnosis for detecting Sri Lankan cassava mosaic virus. Tropical Plant Pathology: 44, pages 236-243.

[6] Uke, A., T. X. Hoat, M. V. Quan, N. V. Liem, M. Ugaki and K. T. Natsuaki. 2018. First Report of Sri Lankan cassava mosaic Virus Infecting Cassava in Vietnam. Plant Disease 102(12): 2669-2669.

[7] Jose Anitha, T. Makeshkumar and S.Edison (2008). Host Range of Sri Lankan cassava mosaic virus. Journal of Root Crops, Vol. 34 No. 1, pp. 21-25.

[8] Yao Chi, Li-Long Pan, Sophie Bouvaine, Yun-Yun Fan, Yin-Quan Liu, Shu-Sheng Liu, Susan Seal, Xiao-Wei Wang (2019) Differential transmission of Sri Lankan cassava mosaic virus by three cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci comμlex. Virology (2019).

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-16:2024 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây hại thực vật - Phần 2-16: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus khảm lá sắn Sri Lanka (Srilankan cassava mosaic virus – SLCMV)