Hình 1- Bào tử đông của nấm Tilletiaindica

(NGUỒN: EPPO)

7.2  Giám định bằng phương pháp PCR

7.2.1  Phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

Bước 1: Rửa sạch bào tử thu được sau khi rửa ly tâm (xem 7.1.1.2) hoặc thu trực tiếp trên mẫu có triệu chứng bệnh bằng cách rửa bằng nước cất trên lưới lọc 20 µm (3.7). Hút dịch thu được vào ống mới thêm nước cất cho đủ 3 ml ngâm qua đêm ở 21 °C.

Bước 2: Ly tâm 4 000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch trong ống chỉ thu phần cặn ly tâm.

Bước 3: Hòa tan cặn ly tâm trong nước, thay nắp mới và lắc nhẹ ống ly tâm (3.10).

...

...

...

Bước 5: Thêm vào 1 ml nước cất vô trùng để rửa cặn ly tâm (Ly tâm và rửa 2 lần).

Bước 6: Tiếp tục ly tâm 1 200 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch rửa.

Bước 7: Hòa tan lại cặn ly tâm trong 1 ml nước cất vô trùng (4.2).

Bước 8: Trang 1 ml dịch hòa tan ở bước 7 lên môi trường Agar (WA) (xem phụ lục B) và đặt ở nhiệt độ 21 °C chu kì ánh sáng 12 giờ tối/12 giờ sáng trong 5 ngày.

Bước 9: Bọc các đĩa môi trường bằng giấy parafilm (3.11), tiếp tục nuôi cấy trong 7 ngày đến 14 ngày.

Bước 10: Cắt miếng thạch có bào tử nảy mầm gắn trên nắp hộp petri trong đó chứa 5 ml môi trường khoai tây dextrose lỏng (PDB) (xem phụ lục B), đặt hộp petri ở 21 °C chu kì ánh sáng 12 giờ tối/12 giờ sáng trong 2 đến 3 ngày.

Bước 11: Kiểm tra sự hình thành bào tử đảm trên bề mặt môi trường nếu chưa thấy nuôi cấy thêm 5 ngày.

Bước 12: Dùng kim khêu nấm (3.1) vô trùng lấy những màng nấm trong môi trường đặt trên các miếng giấy lọc vô trùng để loại bỏ môi trường bám dính.

7.2.2  Tách chiết DNA

...

...

...

Bước 2: Thêm vào 1 ml nước tinh khiết dùng trong công nghệ phân tử (MGW) (4.2) nghiền đều bằng chày thủy tinh hoặc chày nhựa vô trùng (3.13).

Bước 3: Ủ trong 30 giây.

Bước 4: Tách DNA bằng kít tách chiết DNA tổng số của nấm

7.2.3  Nhân gen trong máy chu trình nhiệt

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu:

Tin 3 (5'-CAA TGT TGG CGT GGC GGC GC-3')

Tin 4 (5'-CAA CTC CAG TGA TGG CTCCG-3')

Chu trình nhiệt sử dụng:

94 °C trong 1 phút

...

...

...

65 °C trong 15 giây

72 °C trong 15 giây

72 °C trong 6 phút

25 chu kì

7.2.4  Đọc kết quả

- Điện di bằng agarose gel 2 % (4.3)

- Mẫu dương tính sẽ cho đoạn gen có kích thước 414 bp.

7.3  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài Tilletia indica Mitra khi:

...

...

...

hoặc

- Phương pháp PCR cho kết quả là dương tính.

8  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Tên loài

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục C.

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh than đen lúa mỳ

Tên khoa học: Tilletia indica Mitra

Tên khác: Neovossia indica (Mitra) Mundk.

Vị trí phân loại:

Lớp: Ustilaginomycetes

...

...

...

Họ: Tilletiaceae

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á: India, Afghanistan, Iraq, Nepal, Iran, Pakistan; Châu Phi: South Africa, Kenya; Châu Mỹ: USA, Mexico, Brazil; Châu Âu: Switzeland, Poland, Russian Federation

A.3  Ký chủ

Triticale, Triticum (chi lúa mì), Triticum aestivum (lúa mì)

A.4  Đặc điểm sinh học

Nấm tồn tại trong đất ngay cả khi không trồng lúa mạch trong 2 năm liền vẫn không thể loại trừ mà chỉ làm giảm tỉ lệ bệnh. Tuy vậy sự tồn tại và phát tán của nấm có thể thông qua việc vận chuyển các hạt nhiễm bệnh. Bào tử đông nảy mầm trên mặt đất khi nhiệt độ và ẩm độ phù hợp, nhiệt độ thường là khoảng 20 °C đến 25 °C. Bào tử đông nảy mầm sinh ra đảm đơn bào, hình sợi, trên đó sinh ra bào tử đảm sporidia. Các bào tử đảm sơ cấp sinh ra các bào tử đảm thứ cấp dạng khúc dồi hay thon dài hoặc sợi nấm có thể sinh ra bào tử đảm thứ cấp. Trong hai loại bào tử đảm thứ cấp này dạng khúc dồi có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh trên cây. Dạng bào tử này thuộc loại bào tử bắn (ballistospores). Bào tử đảm sơ cấp và thứ cấp lan truyền nhờ gió và nước mưa tới các bông lúa mạch và là nguồn lây nhiễm chủ yếu. Các ống mầm của các bào tử đảm thứ cấp xâm nhập vào lỗ khí khổng của mày hạt, lá bắc và có thể là cuống hoa mở. Nấm tấn công bầu nhụy và làm cho hạt bị nhiễm bệnh

Bệnh thích hợp với điều kiện khí hậu mát và độ ẩm cao. Nhiệt độ, lượng mưa và ẩm độ là các nhân tố chính trong mô hình cảnh báo sớm bệnh than đen lúa mỳ. Nhiệt độ từ 8 °C đến 20 °C và độ ẩm cao khi có mưa phùn nhẹ trời âm u là điều kiện thích hợp nhất cho sự xâm nhiễm. Điều kiện môi trường đóng vai trò quyết định trong sự xâm nhiễm. Khi thời tiết khô nhiệt độ cao (20 °C đến 25 °C) và trời quang bệnh sẽ khó phát triển.

...

...

...

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nhân tạo

B1  Môi trường PDB

Thành phần

Khoai tây

250 g

Đường (dextrose)

20 g

...

...

...

1 000 ml

Nước chiết khoai tây: Khoai tây không cần gọt vỏ, rửa sạch, thái nhỏ thành từng miếng vuông khoảng 1 cm. Đun khoai tây trong nước cho đến khi mềm (khoảng 1-2 giờ), lọc bằng vải màn để lấy dịch trong.

Khử trùng môi trường trong nồi hấp (xem phụ lục B TCVN 12195-1:2019).

B 2  Môi trường WA

Thành phần

Agar

15 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Khử trùng môi trường trong nồi hấp (xem phụ lục B TCVN 12195-1:2019).

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan giám định
……………………..

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
--------------------

………………. ngày ... tháng ... năm 20 …….

...

...

...

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:

Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

...

...

...

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12 . Phương pháp giám định: Theo TCVN 12195-2-7:2019. Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Tilletia indica Mitra.

13. Kết quả giám định:

Tên tiếng Việt: Bệnh than đen lúa mỳ

Tên khoa học: Tilletia indica Mitra

Tên khác: Neovossia indica (Mitra) Mundk.

Vị trí phân loại:

Lớp: Ustilaginomycetes

...

...

...

Họ: Tilletiaceae

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT
(hoặc người giám định)
(ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ
(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] CABI, (2018), Crop Protection Compedium.

[2] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist's Pocketbook.

[3] IPPC, (2006), ISPM 21 Diagnostic protocols for regulated pests.

...

...

...

[5] Viện Nấm học quốc tế IMI, (1994), Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng, Lớp tập huấn 08-15/12/1994, tại Viện Bảo vệ thực vật, Hà Nội.

[6] https://gd.eppo.int/taxon/NEOVIN

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-2-7:2019 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Tilletia indica Mitra