7.2  Giám định bệnh bằng PCR

7.2.1  Tách chiết DNA

DNA của nấm có thể tách chiết bằng kít thương mại hoặc có thể tách chiết bằng phương pháp sau:

Bước 1: Dùng kim khêu nấm (3.1) thu bào tử của nấm (bào tử đông hoặc bào tử hạ) hoặc dùng dao (3.2) cắt một mẩu mô lá (kích thước 5 mm x 5mm) có chứa ổ bào tử cho vào ống effendorf 1,5 ml (3.4).

Bước 2: Nghiên nhỏ mô hoặc bào tử bằng chày nhựa (3.8) trong Nitơ lỏng (4.1).

Bước 3: Thêm 250 μl dịch chiết nấm (xem phụ lục B.1). Ủ ở nhiệt độ 65 °C trong 1 giờ.

Bước 4: Đặt trong máy ly tâm (3.7), ly tâm tốc độ 12 000 vòng/phút trong 15 phút,

Bước 5: Chuyển 200 μl dịch nổi thu được vào ống effendorf 1,5 ml (3.4) mới, thêm vào ống 7 μl dung dịch Silica (xem phụ lục B.4), 800 μl dung dịch Nal (xem phụ lục B.2). Trộn đều bằng máy trộn dịch (3.5). Ủ trên đá 15 phút, lắc đều sau mỗi 5 phút.

Bước 6: Đặt trong máy ly tâm (3.7), ly tâm 10 giây, loại bỏ phần dịch nổi, thu kết tủa. Hòa tan phần kết tủa trong 800 μl dung dịch rửa (xem phụ lục B.3)

...

...

...

Bước 8: Đặt trong máy ly tâm (3.7), ly tâm tốc độ 3 000 vòng/phút trong 10 giây, loại bỏ phần dịch nổi, thu kết tủa. Úp ngược ống effendorf 1,5 ml (3.4) để khô trên khay men (3.9).

Bước 9: Hòa tan kết tủa thu được ở bước 8 trong 25 μl dung dịch TE (xem phụ lục B.5). Ủ ống ở nhiệt độ 45 °C trong 10 phút.

Bước 10: Đặt trong máy ly tâm (3.7), ly tâm tốc độ 12 000 vòng/phút trong 1 phút đến 2 phút. Kết thúc, chuyển phần dịch nổi sang một ống mới (3.4).

Bước 12: Hòa loãng dịch thu được bằng TE (xem phụ lục B.5) ở tỷ lệ 1/20.

7.2.2  Nhân gen

Sử dụng một trong những cặp mồi đặc hiệu sau đây:

Cặp mồi 1 (Gardes and Bruns (1993)):

- ITS1-F (CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A)

- ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)

...

...

...

- ITS1-F (CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A)

- ITS-Rust1 (GCT TAC TGC CTT CCT CAATC)

Cặp mồi 3 (da S. Machado et al. (2015))

- Ppsi-BtubF (CTT TTG GTT CAC TCT TCA GAC C)

- Ppsi-BtubR (AGA TGA TAA AAG ACT ACT GAC TCC)

Cặp mồi 4 (da S. Machado et al. (2015))

- PPEFF (AAG GAT GCT GCT GAC ATG GGC)

- PPEFR (ATC CCG AAA TGG GGA CAA AAG G)

Chu trình nhiệt sử dụng:

...

...

...

Nhiệt độ

Thời gian

94 °C

3 phút

94 °C

30 giây

30 chu kỳ

...

...

...

30 giây

72 °C

30 giây

72 °C

10 phút

Đối với cặp mồi 2:

Nhiệt độ

Thời gian

...

...

...

94 °C

3 phút

94 °C

30 giây

30 chu kỳ

44 °C

30 giây

72 °C

...

...

...

72 °C

10 phút

7.2.3  Đọc kết quả

- Điện di bằng agarose gel 1,5 % (4.3)

- Mẩu dương tính sẽ cho đoạn gen có kích thước: 700 pb đối với cặp mồi 1; 816 bp đối với cặp mồi 2; 635 bp đối với cặp mồi 3; 1 240 pb đối với cặp mồi 4.

7.3  Giám định bằng phương pháp nested PCR

7.3.1  Tách chiết DNA

...

...

...

7.3.2  Nhân gen

Sử dụng 2 cặp mồi sau (Langrell et al. (2008)):

Cặp mồi 1

- Ppsi1 TTC TAC CTT ATT ACA TGT AGC T

- Ppsi6 GTC ATA TTG ACA GGT TAG AAG C

Và cặp mồi 2

- Ppsi2 ATA GTA ATT TGG TAT ACG TGG C

- Ppsi4 GTC AAT CCA AAT CAA AGT ATG

Chu trình nhiệt sử dụng:

...

...

...

Thời gian

94 °C

3 phút

94 °C

30 giây

30 chu kỳ

57 °C

...

...

...

72 °C

30 giây

72 °C

10 phút

7.3.3  Đọc kết quả

- Điện di bằng agarose gel 1,5 % (4.3)

- Mẫu dương tính sẽ cho đoạn gen có kích thước 379 pb

7.4  Giám định bằng phương pháp real-time PCR

...

...

...

Tách chiết DNA theo điều 7.2.1

7.4.2  Nhân gen

Các mồi sử dụng

A. psidii rDNA ITS1 (Baskarathevan et al. (2016)):

- PpsilTS1F (GTA GCT TTA TTG AAA CAT AGT AA)

- PpsilTS1R TGA TTT TAG ACA AT A AT A ATA AGG G

- PpsilTS1P FAM-AGA TTA ATA TCT TTG CCA CGT ATA CCA-BHQ1

Host cytochrome oxidase (Weller et al. (2000))

- COX-F CGT CGC ATT CCA GAT TAT CCA

...

...

...

- COX-P CAL Fluor Red 610-TGC TTA CGC TGG ATG GAA TGC CCT-BHQ2

Chu trình nhiệt sử dụng:

Nhiệt độ

Thời gian

95 °C

3 phút

95 °C

...

...

...

20 chu kỳ

59 °C

30 giây

7.4.3  Đọc kết quả

Chỉ số Ct của phản ứng dương tính từ 0,8 đến 1,6

7.5  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài Puccinia psidii G. Winter khi:

- Nấm có đặc điểm hình thái phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở điều 7.1.2.

Hoặc

...

...

...

Hoặc

- Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng Nested PCR

Hoặc

- Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng Real-time PCR

8  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

...

...

...

Phiếu giám định chi tiết tham khảo phụ lục C.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh rỉ sắt bạch đàn

Tên khoa học: Puccinia psidii G. Winter

Tên khác:

...

...

...

Dicaeoma psidii (G. Winter) Kuntze

Uredo rangelii J.A. Simpson, K. Thomas & C.A. Grgurinovic

Austropuccinia psidii (G. Winter) Beenken

Vị trí phân loại:

Lớp: Pucciniomycetes.

Bộ: Pucciniales

Họ: Sphaerophragmiaceae

A.2  Phân bố

Trong nước: Chưa có mặt ở Việt Nam

...

...

...

A.3  Ký chủ

Corymbia citriodora, Corymbia maculata, Corymbia torelliana, Eucalyptus (chi Bạch đàn) Eucalyptus botryoides, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus cladocalyx, Eucalyptus cloeziana, Eucalyptus deglupta, Eucalyptus globulus, Eucalyptus gomphocephala, Eucalyptus grandis, Eucalyptus microcorys, Eucalyptus nitens, Eucalyptus paniculata, Eucalyptus pellita, Eucalyptus pilularis, Eucalyptus punctata, Eucalyptus robusta, Eucalyptus saligna, Eucalyptus tereticornis, Psidium (chi ổi), Psidium guajava (ổi), Syzyglum cumini, Syzygium jambos (doi), Acca, Agonis, Allosyncarpia, Angophora, Archirhodomyrtus, Arillastrum, Astartea, Asteromyrtus, Austromyrtus, Backhousia, Baeckea, Barongla, Beaufortia, Callistemon, Calycorectes, Calytrix, Campomanesia, Chamelaucium, Cloezia

A.4  Đặc điểm sinh học

Bào tử hạ nảy mầm khi có sự hiện diện của giọt nước trong điều kiện không có ánh sáng và nhiệt độ từ 15 °C đến 25 °C. Sau khi nảy mầm, các ống mầm xâm nhập trực tiếp vào kí chủ và thường vào giữa hai tế bào biểu bì. Thời kỳ tiềm dục khoảng 5 đến 7 ngày. Các đốm rỉ sắt trưởng thành và giải phóng bào tử sau khoảng 10 đến 12 ngày.

Bệnh phát triển mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ thấp (khoảng 20 °C), độ ẩm cao (80 %) vào ban đêm và có nhiều bào tử trong không khí. Bào tử nấm cũng cần phải tiếp xúc được với cây trong thời kì sinh trưởng hay bật lộc.

Bào tử hạ cần nhiệt độ trung bình (8 °C đến 27 °C, thích hợp nhất là từ 13 °C đến 22 °C) để nảy mầm. Điều kiện ánh sáng yếu cũng thúc đẩy quá trình này. Tỷ lệ nảy mầm tăng đáng kể nếu thời gian tối là hơn 8 giờ. Sinh lý học của cây và phản ứng của chúng với khí hậu quan trọng hơn là khả năng của nấm nói riêng.

Phụ lục B

(Quy định)

...

...

...

B.1  Dịch chiết nấm

Tris - HCI, pH 8,5 (4.4)

200 mM

NaCI (4.5)

250 mM

EDTA (4.6)

25 mM

SDS (4.7)

0,5 %

...

...

...

B.2  Dung dịch Nal

Nal (4.8)

100 g

NaSO₃ (4.9)

1,5 g

Nước cất (4.10)

100 ml

Hòa tan hoàn toàn các thành phần vào nước, lọc dung dịch bằng giấy lọc (4.15), bảo quản trong lọ kín (3.6) ở điều kiện 4 °C.

B.3  Đệm muối phosphat

...

...

...

8 g

KCI (4.11)

0,2 g

Na₂HPO₄ (4.12)

1,44 g

KH₂PO₄ (4.13)

0,24 g

Hòa tan hoàn toàn các thành phần vào 1000 ml nước cất (4.10). Chỉnh pH đến 7,4.

B.4  Dung dịch Silica

...

...

...

10 g

Đệm muối phosphat (B.3)

100 ml

Trộn đều các thành phần, để lắng trong 2 giờ. Loại bỏ dịch nổi phía trên. Lặp lại 2 đến 3 lần.

Ly tâm tốc độ 3 000 vòng/phút trong 2 phút. Trộn đều với 10 ml dung dịch TE

B.5  Dung dịch TE

Tris-HCI (4.4)

10 mM

EDTA (4.6)

...

...

...

1 mM

B.6  Dung dịch rửa

Tris-HCI, pH 8,5 (4.4)

10 mM

NaCI (4.5)

100 mM

EDTA (4.6)

1mM

Ethanol 99,5 % (4.2)

...

...

...

Hòa tan hoàn toàn các thành phần vào Tris-HCI (4.4) (trừ Ethanol 99,5 %). Thêm Ethanol 99,5 % trước khi sử dụng.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan giám định

............................................

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
---------------

...

...

...

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                        Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

...

...

...

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12195-2-12:2020. Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Puccinia psidii G. Winter

13. Kết quả giám định:

Tên tiếng Việt: Bệnh rỉ sắt bạch đàn

Tên khoa học: Puccinia psidii G. Winter

Tên khác:

Bullaria psidii (G. Winter) Arthur & Mains

...

...

...

Uredo rangelii J.A. Simpson, K. Thomas & C.A. Grgurinovic

Austropuccinia psidii (G. Winter) Beenken

Vị trí phân loại:

Lớp: Pucciniomycetes.

Bộ: Pucciniales

Họ: Sphaerophragmiaceae

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT
(hoặc người giám định)
(ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ
(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] CABI (2018), Crop Protection Compedium.

[2] Commonwealth Mycologycal Institute (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

[3] IPPC (2006), ISΜM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.

[4] Viện Bảo vệ thực vật (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.

[5] Viện Nấm học quốc tế IMI (1994), Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng, Lớp tập huấn 08-15/12/1994, tại Viện Bảo vệ thực vật, Hà Nội.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-2-12:2020 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Puccinia psidii G.Winter