Mẫu phải được lấy từ ít nhất 3 cây hoặc lấy ngẫu nhiên từ tập hợp 5000 mẫu bắt nguồn từ ít nhất 20 thanh.

Loại những mẫu thử có khối lượng thể tích sai khác hơn 10% và mẫu đối chứng sai khác hơn 20% so với khối lượng thể tích trung bình của tập hợp mẫu.

5.1.2.3. Số lượng mẫu gỗ

Số lượng mẫu gỗ xác định hiệu lực một loại thuốc với một loài nấm được tính theo công thức (1):

N = 6 x 3 x n x t + 6 + 9

(1)

trong đó:

N: tổng số mẫu gỗ thử nghiệm;

6: số mẫu gỗ cần cho một công thức, gồm: 2 mẫu tẩm thuốc (e₁), 1 mẫu đối chứng không tẩm (e_2.1), 2 mẫu tẩm thuốc đặt vào bình không chứa nấm (e₃) để xác định hệ số điều chỉnh T, 1 mẫu dự phòng;

...

...

...

n: số cấp nồng độ thuốc bảo quản;

t: số phương pháp xử lý bảo quản;

6: số mẫu đối chứng không tẩm đặt trong bình riêng (e_2.2);

9: gồm 6 mẫu tẩm dung môi (e₁) đặt vào bình chứa nấm để xác định ảnh hưởng của dung môi và 3 mẫu đối chứng.

Ký hiệu các mẫu để nhận diện sau quá trình thử nghiệm.

5.2. Vật liệu và tác nhân khác

5.2.1. Nước

Nước sử dụng trong thử nghiệm đạt tiêu chuẩn loại 3 theo TCVN 4851 (ISO 3696).

5.2.2. Môi trường nuôi cấy nấm

...

...

...

Khoai tây

200 g, gọt bỏ vỏ, cắt nhỏ, đun trong 30 phút rồi gạn lấy nước

Glucoza

20 g

Thạch

20 g

Nước cất

1000 ml

Đun hỗn hợp trên cho tan thạch, đổ vào các bình colexan 500 ml, lượng đủ dày 3 mm đến 4 mm khi ở vị trí sử dụng. Đậy nút bông và hấp khử trùng ở 121°C trong 30 phút. Đặt trên mặt phẳng sạch đến khi sử dụng.

...

...

...

5.3.1. Tủ cấy vi sinh đảm bảo vô trùng;

5.3.2. Nồi hấp khử trùng, có nhiệt độ đến 121 °C;

5.3.3. Tủ sấy, có khả năng sấy đến nhiệt độ 160°C;

5.3.4. Cân kỹ thuật, chính xác đến 0,01g;

5.3.5. Panh đặt mẫu;

5.3.6. Ống đong 500 ml, vạch chia 5 ml;

5.3.7. Bình thủy tinh colexan 500 ml;

5.3.8. Thanh đặt chữ U, bằng thủy tinh;

5.3.9. Đĩa Petri,  = 10 cm;

...

...

...

5.3.11. Phòng ổn định mẫu, có khả năng duy trì nhiệt độ (26 ± 2)°C, độ ẩm tương đối (65 ± 5) %;

5.3.12. Phòng nuôi nấm, sạch, tối, duy trì nhiệt độ (26 ± 2)°C, độ ẩm tương đối (70 ±  5)%;

6. Quy trình thử nghiệm

6.1. Xử lý mẫu gỗ trước khi tẩm thuốc

- Mẫu gỗ được sấy khô kiệt ở nhiệt độ (103 ± 2)°C. Làm nguội mẫu đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm. Cân xác định khối lượng khô kiệt của mẫu (m₀), chính xác đến 0,01 g và tính thể tích mẫu. Tính khối lượng thể tích trung bình của tập hợp mẫu.

- Giữ mẫu gỗ trong bình hút ẩm đến khi tẩm.

6.2. Pha thuốc

- Thuốc bảo quản gỗ dạng muối tan trong nước: Pha với nước cất.

- Thuốc bảo quản gỗ tan trong dung môi hữu cơ: Pha với dung môi thích hợp, ví dụ: axeton, clorophooc, xilen...

...

...

...

6.3.1. Ngâm thường

Nhúng chìm mẫu gỗ trong dung dịch thuốc 24 h.

6.3.2. Tẩm chân không

Tạo chân không đạt trị số từ 0,091 MPa đến 0,095 MPa trong 30 min. Đóng van chân không, mở van nối với dung dịch thuốc để bơm dung dịch thuốc cho ngập mẫu. Giữ các mẫu trong dung dung dịch thuốc 2 h. Bổ sung dung dịch thuốc nếu quan sát thấy mẫu không ngập hoàn toàn.

- Vớt mẫu: Các mẫu gỗ sau khi ngâm thường hoặc tẩm được vớt ra khỏi dung dịch thuốc bảo quản, loại bỏ thuốc dư trên bề mặt bằng giấy thấm và cân ngay để xác định khối lượng mẫu sau khi ngâm thường hoặc tẩm thuốc (m₁), chính xác đến 0,01 g.

- Tính lượng thuốc thấm theo công thức:

(2)

trong đó:

...

...

...

m₀: khối lượng khô kiệt của mẫu trước khi tẩm (kg);

m₁: khối lượng của mẫu sau khi tẩm (kg);

c: nồng độ dung dịch thuốc bảo quản (%);

V: thể tích mẫu gỗ tẩm (m³).

- Loại bỏ các mẫu tẩm có lượng thuốc thấm sai khác hơn 15% so với lượng thuốc thấm trung bình của tập hợp mẫu.

6.4. Làm khô và ổn định mẫu sau khi tẩm

Đặt mẫu lên giá thủy tinh để hong phơi trong phòng ổn định mẫu, điều kiện nhiệt độ (26 ± 2) °C, ẩm độ (65 ± 5) % trong 4 tuần. Chỉ đặt các mẫu cùng nồng độ trên một giá, tránh các mẫu chạm vào nhau. Trong thời gian ổn định, lật mẫu 2 lần/tuần cho khô đều.

6.5. Khử trùng mẫu trước khi thử nghiệm

Mẫu trước khi đặt vào bình colexan phải được khử trùng bằng phương pháp phù hợp quy định trong phụ lục A.

...

...

...

Dùng que gạt chuyên dụng cấy nấm vào bề mặt thạch trong bình colexan ở điều kiện vô trùng. Việc cấy này không quá bảy ngày sau khi khử trùng bình colexan chứa môi trường. Sau khi cấy xong, đặt các bình colexan vào môi trường nhiệt độ (26±2) °C, độ ẩm tương đối (70 ± 5) % đến khi nấm phát triển lan kín bề mặt thạch. Thời gian nuôi trước khi đặt mẫu không quá 4 tuần để đảm bảo nấm đang ở pha sinh trưởng. Trong quá trình nuôi, loại bỏ những bình colexan bị nhiễm tạp.

6.7. Phơi nhiễm nấm

Mở nút bông, đặt thanh kê thủy tinh chữ U đã khử trùng lên mặt thạch trong bình colexan. Trên thanh kê chữ U ở mỗi bình, đặt 3 mẫu gỗ của 1 công thức thử nghiệm. Mẫu được đặt theo thứ tự: Hai mẫu tẩm thuốc (e₁) ở 2 bên, 1 mẫu đối chứng (e_2.1) ở giữa, các mẫu cách đều nhau (Hình 1).

Hình 1. Sơ đồ bố trí mẫu thử trong bình colexan

Các mẫu khác cũng đặt 3 mẫu trong một bình: 6 mẫu đối chứng thử độ gây hại (e_2.2) được đặt riêng vào hai bình có nấm; 6 mẫu tẩm dung môi (e₁) và 3 mẫu đối chứng được đặt xen vào ba bình có nấm; các mẫu tẩm thuốc để tính hệ số điều chỉnh (e₃) được đặt vào các bình không có nấm.

Sau khi đặt mẫu gỗ vào các bình, đậy chặt nút bông lại. Xếp các bình trên vào phòng nuôi nấm trong thời gian 4 tháng.

CHÚ Ý: Các thao tác đặt mẫu phải được tiến hành trong môi trường vô trùng.

6.8. Gỡ mẫu sau khi phơi nhiễm nấm

...

...

...

7. Đánh giá hiệu lực của thuốc bảo quản gỗ

7.1. Các căn cứ để đánh giá hiệu lực phòng chống nấm hại gỗ basidiomycetes gồm có:

Hao hụt khối lượng của từng mẫu thử (e₁);

Hao hụt khối lượng của mẫu đối chứng đặt trong cùng bình với mẫu thử (e_2.1);

Hao hụt khối lượng của mẫu đối chứng thử độ gây hại, đặt riêng (e_2.2);

Hao hụt của mẫu tẩm thuốc đặt vào bình không chứa nấm (e₃). Hệ số điều chỉnh (T %) đối với mỗi nồng độ thuốc bằng tỷ lệ hao hụt khối lượng trung bình ở các mẫu e₃.

7.2. Tính tỷ lệ % hao hụt khối lượng của các mẫu e₁, e_2.1, e_2.2, e₃ theo công thức:

(3)

...

...

...

H: tỷ lệ phần trăm hao hụt khối lượng của mẫu (%);

m₀: khối lượng khô kiệt của mẫu trước khi thử nấm (g);

m₂: khối lượng khô kiệt của mẫu sau khi thử nấm (g);

7.3. Tỷ lệ % hao hụt khối lượng thực tế ở các mẫu thử e₁, sau khi điều chỉnh, được tính như sau:

H’(%)=H-T

(4)

trong đó:

H’: tỷ lệ phần trăm hao hụt khối lượng thực tế của mẫu thử e₁ (%);

H: tỷ lệ phần trăm hao hụt khối lượng của mẫu (%);

...

...

...

7.4. Kết luận hiệu lực thuốc: dựa vào % hao hụt khối lượng thực tế của mẫu thử e₁ (H ) theo Bảng 2

Bảng 2. Xác định hiệu lực của thuốc bảo quản với nấm basidiomycetes

Hao hụt khối lượng của mẫu thử (%)

Hiệu lực

0 < H’ ≤ 5

Tốt

5 < H’ ≤ 10

Khá

10 < H’ ≤ 20

...

...

...

H’ > 20

Kém

7.5. Điều kiện chấp nhận kết quả

7.5.1. Kết quả thử nghiệm được chấp nhận khi tỷ lệ % hao hụt về khối lượng trung bình ở mẫu đối chứng để riêng  15% (đối với gỗ trám trắng hoặc nấm Lentinus edodes) hoặc  20% (đối với các trường hợp còn lại).

7.5.2. Kết quả thử nghiệm của mẫu trong bình thử được coi là hợp lệ nếu đạt được các điều kiện sau:

7.5.2.1. Mẫu thử không có bị nhiễm vi sinh vật khác trên bề mặt;

7.5.2.2. Hao hụt khối lượng của mẫu đối chứng đặt trong cùng bình colexan  15%.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp thuốc bảo quản gỗ gây ra tác động chéo trong bình thử (thuốc từ mẫu thất thoát ra bình làm nấm không phát triển được, do đó khối lượng hao hụt của mẫu đối chứng bị sai lệch) thì không áp dụng điều kiện 7.5.2.2. Tuy nhiên, phải ghi rõ trong báo cáo về hiện tượng tác động chéo quan sát được.

8. Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

a. Số hiệu và năm công bố của tiêu chuẩn;

b. Tên đơn vị cung cấp thuốc thử nghiệm;

c. Tên và nồng độ hoạt chất;

d. Ngày sản xuất thuốc;

e. Dung môi hoặc chất pha loãng được sử dụng;

f. Tên loài gỗ thử nghiệm;

g. Khối lượng thể tích trung bình của loài gỗ thử nghiệm;

h. Loài nấm thử nghiệm;

i. Nồng độ thuốc theo % khối lượng;

...

...

...

k. Thời gian ổn định mẫu;

I. Phương pháp khử trùng mẫu gỗ;

m. Ngày phơi nhiễm nấm;

n. Ngày gỡ mẫu sau khi phơi nhiễm nấm;

o. Hệ số điều chỉnh T cho mỗi nồng độ thuốc;

p. Hao hụt khối lượng mỗi mẫu và hao hụt khối lượng trung bình của mỗi nồng độ thuốc, loại gỗ, loài nấm;

q. Hao hụt khối lượng trung bình của mẫu đối chứng thử độ gây hại của mỗi chủng nấm;

r. Tên tổ chức chịu trách nhiệm cho báo cáo và ngày ban hành;

s. Tên và chữ ký của người chịu trách nhiệm;

...

...

...

u. Diễn giải và kết luận thực tế từ báo cáo thử nghiệm cần đến các kiến thức chuyên môn về độ bền gỗ và bảo quản gỗ, do đó báo cáo này không thể được coi là một chứng chỉ phê duyệt.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Phương pháp khử trùng mẫu gỗ trước khi đặt vào bình nuôi cấy nấm

A1. Khử trùng bằng nhiệt

Phương pháp này chỉ được sử dụng thuốc bảo quản bền nhiệt và không bay hơi trong hơi nước nóng.

Trước ngày đặt mẫu thử trong bình nuôi cấy, đặt các mẫu trong túi polyetilen chịu nhiệt. Trên một túi chỉ được đặt các nhóm mẫu giống nhau, sắp xếp các mẫu không chạm vào nhau bằng cách đặt tấm thủy tinh hoặc thép không gỉ giữa các mẫu.

Đóng kín các túi và đặt vào nồi hơi trong vòng 20 min.

...

...

...

Không được mở túi cho đến khi đặt mẫu vào bình nuôi cấy.

A2. Khử trùng bằng Epoxyetan

Phương pháp này không sử dụng cho thuốc bảo quản hữu cơ, thuốc bảo quản chứa boron hoặc hợp chất của clo hoặc hợp chất phenol.

Đặt các mẫu riêng biệt trong túi polyetilen tỷ trọng thấp và gắn kín miệng. Đặt các túi chứa mẫu trong thiết bị chuyên dụng và xông khí Epoxyetan nồng độ 1,2 g/l, áp suất 0,55 MPa, nhiệt độ 55°C và độ ẩm tương đối 70% đến 80% trong 1 h. Sau đó thông khí sạch các túi 120 h. Không được mở túi cho đến khi đặt mẫu vào bình nuôi cấy.

A3. Khử trùng bằng Epoxypropan

Phương pháp này không sử dụng cho thuốc bảo quản hữu cơ, thuốc bảo quản chứa boron hoặc hợp chất của clo hoặc hợp chất phenol.

Đặt các mẫu riêng biệt trong túi polyetilen tỷ trọng thấp và gắn kín miệng. Đặt các túi chứa mẫu trong thiết bị chuyên dụng và xông khí Epoxypropan nồng độ 2 ml/l trong 24 h. Sau đó thông khí sạch các túi ít nhất 120 h. Không được mở túi cho đến khi đặt mẫu vào bình nuôi cấy.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10753:2015 về Thuốc bảo quản gỗ - Phương pháp xác định hiệu lực với nấm hại gỗ basidiomycetes