4. Nguyên tắc

Hesperidin và naringin chiết được trong dung dịch dimethylformamid. Sau khi gia nhiệt ở 90 °C, phần lỏng của mẫu đã lọc qua màng lọc được tách bằng HPLC pha đảo, sử dụng detector-UV và tính hàm lượng chất phân tích bằng phương pháp ngoại chuẩn.

5. Thuốc thử

5.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đạt loại 1 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

5.2. Axit axetic.

5.3. Axit axetic, c(CH₃COOH) = 0,01 mol/l.

5.4. Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

5.5. Di-amoni oxalat ngậm một phân tử nước, (NH₄)₂C₂O₄.H₂O.

...

...

...

5.7. Hesperidin (3.2).

5.8. Naringin (3.2).

5.9. Dung dịch chuẩn naringin và hesperidin.

Để chuẩn bị dung dịch gốc, hòa tan 120 mg naringin (5.8) và hesperidin (5.7) trong 20 ml dimethyformamid (5.6) trong bình định mức 100 ml.

Sau khi hòa tan, thêm dung dịch axit axetic (5.3) đến vạch. Để chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc hesperidin/naringin (120 mg/l đối với mỗi chất) thì pha loãng dung dịch gốc (1 200 mg/l) 1 phần thể tích thành 10 phần thể tích, dùng hỗn hợp dung dịch axit axetic (5.3) và dimethylformamid (5.6) (8:2 phần thể tích). Dung dịch chuẩn làm việc bền trong 30 ngày khi được bảo quản ở 4 °C. Từ dung dịch gốc (1 200 mg/l) chuẩn bị các dung dịch chuẩn tiếp theo bằng cách pha loãng dung dịch gốc với hỗn hợp của dung dịch axit axetic (5.3) và dimethylformamid (5.6) (8:2 phần thể tích) để có được các dung dịch chứa tương ứng 60 mg/l, 30 mg/l và 15 mg/l hesperidin và naringin.

5.10. Dung dịch amoni oxalat, c(NH₄)₂C₂O₄.H₂O) = 0,025 mol/l.

Dung dịch ammoni oxalat được chuẩn bị bằng cách hòa tan 3,55 g di-amoni-oxalat ngậm một phân tử nước (5.5) trong 1000 ml nước.

5.11. Pha động dùng cho phân tích HPLC

Pha động dùng cho phép xác định hesperidin và naringin được chuẩn bị bằng cách trộn 200 ml axetonitril (5.4), 800 ml nước và 0,5 ml axit axetic (5.2). Đong riêng axetonitril và nước, chuẩn bị chính xác thành phần của pha động.

...

...

...

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

6.1. Bình định mức, dung tích 50 ml.

6.2. Pipet, dung tích 10 ml.

6.3. Bộ lọc dùng một lần, không phải khử trùng, thấm nước (cỡ lỗ 0,45 μm) để lọc dung dịch mẫu.

6.4. Cột HPLC

Cột HPLC, C18, kích thước 250 mm x 4 mm, cỡ hạt 5 μm;

Cột HPLC, C18, kích thước 250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt 5 μm.

6.5. Thiết bị HPLC: gồm bơm, cột (6.4) và detector UV.

6.6. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ đến 90 °C.

...

...

...

7.1. Chuẩn bị mẫu

Thông thường các mẫu không cần xử lý trước, tuy nhiên có thể cần pha loãng và phép phân tích theo phương pháp này nên dựa vào thể tích, các kết quả được biểu thị trên 1 lít mẫu. Đối với các mẫu cô đặc, có thể cũng tiến hành phân tích dựa vào thể tích, sau khi pha loãng đến tỷ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp này, tỷ trọng tương đối phải được nêu rõ. Dựa vào lượng mẫu đã cân và hệ số pha loãng, các kết quả có thể cũng được biểu thị trên 1 kg mẫu. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có chứa lượng thịt quả rất cao thì thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử. Cần trộn kỹ mẫu đục trước khi pha loãng.

7.2. Qui trình thử nghiệm

7.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng. Trộn kỹ mẫu trước khi mở vật chứa và lấy ngay mẫu thử (7.1). Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thử hoặc mẫu sản phẩm đặc đã pha loãng (7.1) cho vào bình định mức 50 ml (6.1). Sau đó thêm 10 ml dung dịch amoni oxalat (0,025 mol/l) (5.10) và 10 ml dimethylformamid (5.6). Trộn kỹ mẫu đã pha loãng và thêm nước đến vạch (50 ml). Gia nhiệt mẫu trên nồi cách thủy (6.6) có kiểm soát nhiệt độ ở 90 °C trong 10 min. Sau khi nguội đến nhiệt độ phòng, lọc phần lỏng của dung dịch qua bộ lọc màng (6.3) trước khi phân tích bằng HPLC.

7.2.2. Phép đo HPLC

Sau khi cân bằng hệ thống HPLC, tiến hành phân tích mẫu [dùng máy HPLC (6.5), cột (6.4), pha động (5.11)].

Khi sử dụng detector có bước sóng cố định thì đo ở bước sóng 280 nm hoặc trong trường hợp dùng detector có bước sóng thay đổi thì đo ở 287 nm. Việc phát hiện thường nhạy trong khoảng 0,05 đến 0,2 AUFS.

Tốc độ dòng: khoảng 1 ml/min

...

...

...

Dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu được bơm liên tục.

Độ ổn định của dung dịch mẫu bị giới hạn do đó nên kết thúc phép thử trong vòng 24 h.

8. Tính kết quả

Phép tính được tiến hành theo phương pháp ngoại chuẩn, bằng cách tích phân diện tích pic hoặc đo chiều cao pic cần tính đến thời gian lưu và cần tính đến độ tuyến tính của đường chuẩn. Trong suốt quá trình tính, có tính đến mọi hệ số pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích. Nếu sản phẩm đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó.

Tính hàm lượng hesperidin và naringin, ρ_H và ρ_N của từng mẫu sử dụng các Công thức sau:

                                                  (1)

                                                  (2)

Trong đó:

A_HP là diện tích pic của hàm lượng hespiridin trong mẫu;

...

...

...

XF là hệ số pha loãng (bằng 5 đối với nước quả, đối với mẫu đặc đã pha loãng thì cần tính đến hệ số pha loãng);

RF_H là hệ số đáp ứng đối với hesperidin;

RF_N là hệ số đáp ứng đối với naringin.

Tính hệ số đáp ứng sử dụng các Công thức sau:

và

Trong đó:

A_HS là diện tích pic của hàm lượng hesperidin trong dung dịch mẫu (5.9);

...

...

...

r_HS là hàm lượng hesperidin trong dung dịch chuẩn (5.9);

r_NS là hàm lượng naringin trong dung dịch chuẩn (5.9);

Biểu thị kết quả naringin và hesperidin bằng miligam trên lít.

9. Độ chụm

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục A.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Độ lặp lại là:

Hesperidin

...

...

...

Naringin

r = 27 mg/l;

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm phân tích, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

Độ tái lập là:

Hesperidin

R = 61 mg/l;

Naringin

R = 72 mg/l.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu);

- viện dẫn tiêu chuẩn này;

- ngày và kiểu quy trình lấy mẫu (nếu biết);

- ngày nhận mẫu;

- ngày thử nghiệm;

- kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị;

- độ lặp lại của phương pháp đã được đánh giá;

- các điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các thông số sau đây thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725:1986 (Đối với tài liệu liên quan đến phương pháp, xem Thư mục Tài liệu tham khảo). Phép thử do Hiệp hội Quả quốc tế, Paris, Pháp tổ chức thực hiện.

Hesperidin

Naringin

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm:

...

...

...

1989

Số lượng các phòng thử nghiệm:

22

10

Số lượng mẫu:

1

1

Bảng A.1 - Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Mẫu

...

...

...

Naringin

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

21

10

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

1

-

Số lượng các kết quả được chấp nhận

109

...

...

...

Giá trị trung bình  (mg/l)

438

523

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r) (mg/l)

6,74

9,53

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r) [%]

1,5

1,8

...

...

...

19

27

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R) (mg/l)

21,48

25,40

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD_R) [%]

4,9

4,9

Giới hạn tái lập (R) (mg/l)

...

...

...

72

Phép xác định hesperidin đã được thực hiện trên nước cam. Phép xác định naringin đã được thực hiện trên nước nho.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Ví dụ về sắc đồ

Hình B.1 - Phổ UV của hesperidin kết tinh lại trong pha động

...

...

...

Hình B.3 - Sắc đồ HPLC của nước cam

Hình B.4 - Sắc đồ HPLC của nước nho

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Determination of hesperidin and naringin by HPLC: No. 58, 1991. In: The collected Analyses of the International Federation of Fruit Juice Producers. Loose-leaf edition, as of 1996. Zug: Swiss Fruit Union.

[2] GREINER, G., WALLRAUCH, S. Flussiger Obst 51, 1984, 626.

1) ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatabilily and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory test dùng để thu được dữ liệu về độ chụm. Tiêu chuẩn này đã hủy và được thay bằng bộ tiêu chuẩn ISO 5725 (gồm 6 phần) và đã được chấp nhận thành bộ TCVN 6910 (ISO 5725).

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10389:2014 ( EN 12148:1996) về Nước rau, quả - Xác định Hesperidin và Naringin trong nước rau quả có múi - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao