4. Đặc điểm hình thái bào tử nấm Tilletia indica

Bào tử đông (Teliospore) dạng cầu tới gần cầu, đường kính thông thường 22-47mm, có thể lớn hơn (35-41mm); Màu sắc từ vàng cam nhạt tới nâu tới nâu đậm, đỏ nâu; một số bào tử có màu đen hoặc màu đen mờ. Gai dày đầu gai nhọn hoặc tù, một số trường hợp đầu hơi cong, độ dài gai 1,5-5,0mm. Bề mặt gai có dạng vỏ não với những rãnh hẹp. Các gai được bao bọc bởi một màng mỏng trong suốt (hình 3 hình 4).

Tế bào bất dục: hình cầu tới gần cầu hoặc hình giọt lệ, màu vàng nâu, 10-28x48mm, có hoặc không có đỉnh nhỏ (gai ngắn), vách tế bào mượt dày khoảng 7mm và tạo phiến.

Hình 3: Bề mặt bào tử T. indica

(Nguồn: EPPO, 2012)

Hình 4: Bào tử T. indica quan sát ở điểm giữa

(Nguồn: EPPO, 2012)

...

...

...

Bào tử đông của T. indica có thể bị nhầm lẫn bởi một số loài Tilletia lẫn tạp trong hạt lúa mỳ như: T. walkeri (hình 5) và T. horrida (hình 6) có thể phân biệt như sau.

T. horrida

T. walkeri

T. indica

Kích thước bào tử to nhất (mm)

<36

36-45

45-50

...

...

...

24-28

30-31

35-41

Màu sắc bào tử đông

Vàng nhạt tới màu hạt dẻ nhạt hoặc đậm (tới đen mờ)

Vàng nhạt tới nâu đỏ (không có màu đen đục)

Màu cam nhạt nhưng chủ yếu là màu đỏ nâu đậm tới đen mờ

Hình thái và phân bố gai

Gai nhọn, nhìn bề mặt có nhiều góc cạnh; ít khi có dạng rãnh vỏ não hoặc hiếm khi có dạng bụi. Đầu gai nhọn, có thể trở thành cụt, ít khi cong

...

...

...

Gai dày, có dạng vỏ não. Đầu gai nhọn hoặc gẫy đầu.

Hình 5: Bào tử T. walkeri

(thước 10um)

Nguồn: PaDIL, 2012

Hình 6: Bào tử T. horrida

(thước 10um)

Nguồn: PaDIL, 2012

...

...

...

Phụ lục 2.

(quy định)

Quy trình giám định nấm T. indica bằng PCR

1. Nhân sinh khối.

Rửa sạch bào tử thu được ở phương pháp rửa bằng cách rửa bằng nước cất trên lưới lọc 20mm. Hút dịch thu được vào ống mới thêm nước cất cho đủ 3ml ngâm qua đêm ở 21^oC. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch trong ống chỉ thu phần cặn ly tâm. Hòa tan cặn ly tâm trong nước xà phòng 10%, thay nắp mới và lắc nhẹ ống ly tâm. Ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 1 phút loại bỏ dịch rửa. Thêm vào 1ml nước cất vô trùng để rửa cặn ly tâm (Ly tâm và rửa 2 lần).Tiếp tục ly tâm 1200g trong 5 phút loại bỏ dịch rửa. Hòa tan lại cặn ly tâm trong 1ml nước cất vô trùng. Trang 200ml dịch hòa tan ở bước 10 lên môi trường Agar (WA) nuôi cấy ở 21^oC chu kì ánh sáng 12 giờ tối/12 giờ sáng trong 5 ngày. Bọc các đĩa môi trường bằng giấy parafilm hoặc cho vào túi bóng, tiếp tục nuôi cấy trong 7-14 ngày.

Kiểm tra sự nảy mầm của bào tử. Cắt miếng thạch có bào tử nảy mầm gắn trên nắp hộp petri trong đó chứa 5ml môi trường khoai tây dextrose lỏng (potato dextrose broth), nuôi cấy ở 21^oC chu kì ánh sáng 12 giờ tối/12 giờ sáng trong 2-3 ngày. Kiểm tra sự hình thành bào tử đảm trên bề mặt môi trường nếu chưa thấy nuôi cấy thêm 5 ngày. (hình 7). Dùng kim khêu vô trùng lấy những màng nấm trong môi trường đặt trên các miếng giấy lọc vô trùng để loại bỏ môi trường bám dính. Đặt các màng nấm vào các ống để tách chiết DNA.

...

...

...

T. walkeri

T. horrida

Hình 7: Tản nấm trên môi trường PDA sau 14 ngày

Nguồn: EPPO, 2007

2. Tách chiết DNA

0,1g nấm thu được cho vào ống ly tâm 2ml. Thêm vào 1ml nước tinh khiết dùng trong công nghệ phân tử (MGW) nghiền đều bằng chày thủy tinh hoặc chày nhựa vô trùng. Ủ trong 30 giây. Tách DNA bằng kít tách chiết DNA tổng số của nấm.

3. Giám định bằng PCR

- Cặp mồi sử dụng

Mồi xuôi Tin 3 (5'-CAA TGT TGG CGT GGC GGC GC-3')

...

...

...

- Master mix:

20,2 ml of MGW

2,5 mL of 10 X PCR buffer chứa 15 mM MgCI2

0,25 mL dNTPs [10 mM]

0,1 mL AmpliTaq [5 U mL-1]

0,1 mL of mỗi mồi [25 mM]

1,0 mL dịch DNA chiết tách từ nấm

- Chu trình nhiệt

94^oC trong 1 phút,

...

...

...

72^oC trong 6 phút.

- Đọc kết quả:

- Điện di bằng agarose gel 2% Mẫu dương tính sẽ cho đoạn gen có kích thước 414kbp

Phụ lục 3.

(quy định)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan Bảo vệ
và Kiểm dịch thực vật
………………………………………..

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
--------------

...

...

...

……….. ngày …. tháng …. năm 20…..

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

Bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

1. Tên hàng hóa

:

2. Nước xuất khẩu

:

3. Xuất xứ

...

...

...

4. Phương tiện vận chuyển

:

Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu

:

6. Ngày lấy mẫu

:

7. Người lấy mẫu

:

...

...

...

:

9. Ký hiệu mẫu

:

10. Số mẫu lưu

:

11. Người giám định

:

12. Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT về "Quy trình giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam".

13. Kết quả giám định

...

...

...

Lớp: Ustilaginomycetes

Bộ: Tilletiales

Họ: Tilletiaceae

Là dịch hại kiểm dịch thực vật thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT
(hoặc người giám định)
(ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ
(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

1 Trường hợp các văn bản viện dẫn trong quy chuẩn này sửa đổi, bổ sung hoặc thay thế thì thực hiện theo quy định của văn bản mới.

Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-159:2014/BNNPTNT về quy trình giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam