Chu trình nhân gien

1 vòng

94°C - 2 phút

37°C - 1 phút

35 vòng 

94°C - 1 phút

55°C - 1 phút

...

...

...

72°C - 3 phút 

1 vòng

72°C for 7 phút

Giữ ở 4^oC đến khi chạy điện di

Chạy điện di sản phẩm PCR

- Pha thạch Agar 1% bằng dung dịch đệm TAE, đun cho tan đều, khi đã nguội, đổ vào khuôn điện di (có lược)

- Khi thạch đã đông, để vào trong buồng điện di có đệm TAE

- Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch loading với tỷ lệ 1/10 và nhỏ vào các giếng trên miếng thạch Agar (10 µl/mẫu)

...

...

...

c. Đọc kết quả:

- Mẫu đối chứng dương và các mẫu dương tính có vạch với kích cỡ 446 bp

- Mẫu đối chứng âm và các mẫu âm tính không có vạch.

5.3.2. Phát hiện kháng thể:

Sử dụng phương pháp trung hoà (SN – Serum Nertralization) để phát hiện kháng thể: Phương pháp này được thực hiện trên trứng vịt có phôi, hoặc trên tế bào DEF

Mẫu: là huyết thanh vịt nghi mắc bệnh.

5.3.2.1. Trên trứng vịt có phôi: 10-14 ngày tuổi.

- Chuẩn bị:

+ Xử lý mẫu huyết thanh ở 56^oC /30p.

...

...

...

+ Pha loãng virus DTV liều 100 EID₅₀.

- Tiến hành:

+ Trộn virus DTV và huyết thanh kiểm tra đã chuẩn bị ở trên theo tỷ lệ 1:1

+ Ủ hỗn hợp kháng nguyên – kháng thể ở tủ ấm 37^oC/1h .

+ Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô phôi trứng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nồng độ.

+ Trứng được ấp tiếp ở 37^oC trong 14 ngày.

+ Soi trứng. Loại bỏ những phôi chết tr­ước 24h.

- Đánh giá kết quả:

+ Phôi chết xảy ra trong 4-10 ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.

...

...

...

5.3.2.2. Trên tế bào xơ phôi vịt DEF:

- Chuẩn bị:

+ Làm và pha loãng tế bào DEF với số lư­ợng cần thiết (4x10⁵ tế bào/ml).

+ Xử lý mẫu huyết thanh ở 56^oC /30p.

+ Pha loãng virus DTV chuẩn liều 100 TCID₅₀(50% Tissue culture infective dose).

- Tiến hành: Trên đĩa nuôi cấy 96 lỗ.

+ Cho môi tr­ường nuôi cấy MEM: 50µl/lỗ vào các lỗ của đĩa.

+ Cho mẫu huyết thanh kiểm tra: 50µl vào lỗ đầu tiên, cột 1.

+ Pha loãng mẫu huyết thanh theo cơ số 2 (1/2, 1/4,...) từ cột 1-12.

...

...

...

+ Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO₂ ở 37^oC/1h .

+ Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường MEM (không bổ sung FCS) 100µl/lỗ.

+ Ủ tiếp đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO₂ ở 37^oC trong 5-7 ngày.

- Đánh giá kết quả:

+ Kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày. Tế bào có biểu hiện to tròn và tụ lại từng đám, thời gian lâu có hiện tượng tế bào bị hoại tử.

+ Tính toán chỉ số trung hoà NI và hiệu giá trung hoà theo công thức của Reed và Muench.

6. Kết luận:

- Nếu kết quả phân lập và giám định (bằng phương pháp trung hòa VN) dương tính với kháng huyết thanh chuẩn, kết luận có virus Dịch tả vịt.

- Nếu kết quả PCR dương tính, kết luận dương tính virus Dịch tả vịt.

...

...

...

- Nếu kết quả phân lập âm tính, PCR âm tính, kết luận âm tính virus Dịch tả vịt.

7. Tài liệu tham khảo

1. Manual of standards for diagnosis tests and vaccines (OIE).

2. Manual of standards for diagnosis tests (Thailand).

PHỤ LỤC

1. Công thức pha môi trường:

• Dung dịch PBSx10:

Thành phần:

...

...

...

KCl                               2,0gr

Na₂HPO4                      11,5gr

KH₂PO4                        2,0gr

Pha loãng với 1000ml n­ước cất, điều chỉnh pH = 7,2.

Hấp tiệt trùng, bảo quản ở 4^oC.

• 7% NaHCO₃:

Thành phần:

NaHCO₃                        7gr

N­ước cất                      100ml

...

...

...

• 3% L-glutamine:

Thành phần:

L-glutamine                   3 gr

N­ước cất                      100ml

Lọc vô trùng, bảo quản ở -20^oC. Pha loãng virus VGV chuẩn liều 100 TCID₅₀.

• TPB – Tryptose Photphat Broth:

• Thành phần:

Tryptose Photphat          29,5gr

Nước cất                      1000ml

...

...

...

• Trypsine 2,5% (10x):

Thành phần:

Trypsine                        2,5gr

PBS                             100ml

Lắc qua đêm ở 4^oC, lọc vô trùng và bảo quản ở -20^oC.

• Môi tr­ường nuôi cấy tế bào MEM:

Thành phần:

Eagle’s minimum essential medium (MEM)         430 ml

Tryptose Photphat Broth (TPB)                          50 ml

...

...

...

7% NaHCO₃                                                     5 ml

Kháng sinh (Peni. + Strep.)                                5 ml

Fetal calf serum (FCS)                                      5 ml

2. Phương pháp làm tế bào Xơ phôi vịt

Sử dụng phôi vịt 9 -10 ngày tuổi.

1 - Mổ trứng, lấy phôi vịt.

2 - Rửa phôi trong dung dịch PBS có chứa 1% kháng sinh.

3 - Cắt bỏ đầu, chân, cánh và các cơ quan phủ tạng, thu hoạch gan phôi.

4 - Rửa phôi 1-2 lần trong dung dịch PBS có chứa 1% kháng sinh.

...

...

...

6 - Tách tế bào bằng dung dịch Trypsine ấm 0,25% và lắc nhẹ 250v/p trong 15 phút.

7 - Thu hoạch tế bào đã tách cho vào môi trư­ờng MEM + 10% huyết thanh FCS, bảo quản trong phích đá.

8 - Nhắc lại bước 6-7.

9 - Ly tâm huyễn dịch tế bào 1500v/p, ở 4^oC trong 5 phút.

10 - Rửa 1 lần với môi trường nuôi cấy.

11 - Đếm và pha loãng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10% FCS), lượng tế bào cần thiết tối thiểu 4x10⁵ tế bào/ml.

4. Công thức tính chỉ số trung hoà NI của Reed and Muench.

4.1. Phương pháp trung hoà virus (VN):

...

...

...

Virus pha loãng (log₁₀)

-1

-2

-3

-4

-5

-6

-7

-8

...

...

...

NI

Hthanh (-)

*5/5

4/5

1/5

...

...

...

6.5

Hthanh (+)

5/5

5/5

0/5

...

...

...

2.5

4.0

*: số chết/số tiêm.

Chỉ số NI là sự chênh lệch giữa EID50 (hoặc LD50, TCID50)của lô đối chứng (+) và (-)

Chỉ số NI = 4.0

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 815:2006 về quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả vịt