Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 1 h. Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

A.2  Chuẩn bị kháng nguyên thân (KNO - Somatic antigen - KN xử lý acid EDTA)

A.2.1  Cấy 0,01 ml vi khuẩn Actinobacilus pleuropneumoniae cường độc (5.1) vào môi trường thạch chocolate bổ sung NAD 5% (A.1), ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h

A.2.2  Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch chocolate (A.2.1) cấy vào môi trường canh thang BHI (A.1) bổ sung NAD 5%, rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h

A.2.3  Láng 4 ml canh trùng (A.2.2) lên 2 đĩa thạch chocolate (A.1) rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h

A.2.4  Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch chocolate (A.2.3) bằng cách dùng 5ml PBS rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm

A.2.5  Nhỏ 0,02 ml Formaldehyde solution 37% (A.1) vào huyễn dịch vi khuẩn thu được (A.2.4) rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn

A.2.6  Huyễn dịch vi khuẩn (A.2.5) đạt chỉ tiêu vô trùng sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm (6.5) với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4 °C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng 20 ml EDTA 1%, lắc đều rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h

A.2.7  Sau đó tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.6) bằng máy ly tâm (6.5) với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4 °C, cặn thu được sẽ rửa bằng 5 ml PBS có bổ sung 0,3% Formaldehyde solution min 37% (A.1), lặp lại 2 lần.

...

...

...

A.2.9  Kiểm tra kháng nguyên (A.2.8) xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết.

A.3  Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra

Lấy máu động vật (8.4.3.2), chắt lấy huyết thanh. Sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi cách thủy (6.6) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.

A.4  Cách tiến hành

Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên O (kháng nguyên Somatic) thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U

Sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm

- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên

- Đối với các giếng thí nghiệm:

...

...

...

+ Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl huyết thanh và pha loãng huyết thanh theo cơ số 2

+ Nhỏ vào các giếng 50 μl kháng nguyên

- Đối với các giếng đối chứng:

+ Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl kháng nguyên

+ Đối chứng dương: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl huyết thanh tối miễn dịch và pha loãng theo cơ số 2 + 50 μl kháng nguyên

- Lắc nhẹ cho đều rồi dính băng dính để ở tủ ấm 37 °C (6.1) qua đêm

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: Kháng nguyên lắng tròn đáy giếng

+ Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ASEAN Standards for Animal Vaccines (Second Edition): Requirements for Actinobacillus pleuropneumoniae Bacterin

[2] Alexander Maas, Ilse D. Jacobsen, Jochen Meens and Gerald-F. Gerlach* Use of an Actinobacillus pleuropneumoniae Multiple Mutant as a Vaccine That Allows Differentiation of Vaccinated and Infected Animal, Institute for Microbiology, Department of Infectious Diseases, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, 30173 Hannover, Germany

[3] Mario Jacques1, Isolation of an Atypical Strain of Actinobacillus pleuropneumoniae Serotype 1 with a Truncated Lipopolysaccharide Outer Core and No O.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-17:2017 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn