A.2.2.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan tím tinh thể trong ethanol và amoni oxalat trong nước cất. Trộn hai dung dịch và để hỗn hợp ổn định trong 24 h trước khi sử dụng.

A.2.2.3  Dung dịch iod

A.2.2.3.1  Thành phần

lod

1,0 g

Kali iodid (Kl)

2,0 g

Nước

...

...

...

A.2.2.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan Kali iodid trong 10 ml nước cất, từ từ thêm từng lượng nhỏ iod vào dung dịch.

Sau khi hòa tan, thêm nước cho đến vạch 100 ml trong bình định mức.

A.2.2.4  Dung dịch Safranin

A.2.2.4.1  Thành phần

Safranin O

0,25 g

Ethanol (95 %)

10 ml

...

...

...

100 ml

A.2.2.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan safranin trong ethanol sau đó trộn với nước cất để được thể tích cuối cùng là 100 ml.

Khi tím tinh thể được sử dụng, sự ổn định của dung dịch cần được kiểm chứng bằng cách trộn một giọt dung dịch tinh thể tím với một giọt dung dịch iod trên mặt lam kính để quan sát phản ứng hóa học. Nếu thấy kết tinh trên mặt kính, không sử dụng dung dịch tím tinh thể.

A.2.2.5  Kỹ thuật nhuộm

Sau khi đã cố định vết vi khuẩn (được chuẩn bị từ dịch nuôi từ 18 h đến 24 h, hoặc từ canh thang đục) trên lam kính (ví dụ với ngọn lửa) thì phủ lên vết này dung dịch tím tinh thể (xem A.2.2.2). Để phản ứng xảy ra trong 1 min.

Rửa nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài s.

Phủ lên lam kính dung dịch iod (A.2.2.3). Để phản ứng xảy ra trong 1 min. Rửa nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài s.

Đổ nhẹ nhàng và liên tục một lớp mỏng dung dịch ethanol (95 %) lên lam kính để nghiêng trong khoảng thời gian không quá 30 s cho đến khi không còn màu tím.

...

...

...

Phủ lên lam kính bằng dung dịch safranin (A.2.2.4) trong 10 s.

Rửa nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài s. Làm khô lam kính.

A.2.2.6  Cách đọc kết quả

Quan sát lam kính dưới kính hiểm vi có độ phóng đại cao (5.13). Các tế bào vi khuẩn có màu xanh hoặc tím là Gram dương; có màu từ hồng thẫm đến đỏ là Gram âm.

Một số loại vi khuẩn thuần chủng có thể có cả tế bào Gram dương và Gram âm trong cùng một thị trường của kính hiển vi.

LƯU Ý: Các tế bào vón đặc có thể cho hình ảnh không đặc trưng.

A.3  Phản ứng catalase

A.3.1  Quy định chung

Việc phát hiện enzyme phân hủy hydrogen peroxid (H₂O₂) để tạo nước và oxy, có thể được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường lỏng, môi trường thạch có cấy vi sinh vật hoặc một khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch.

...

...

...

Thêm vào 1 ml môi trường, 0,5 ml dung dịch hydrogen peroxid 10 thể tích (3 % khối lượng). Quan sát sự xuất hiện của bọt khí oxy (catalase dương tính) hoặc không có bong bóng oxy (catalase âm tính).

A.3.3  Từ môi trường thạch

Nhỏ lên môi trường từ 1 ml đến 2 ml dung dịch hydrogen peroxid 10 % thể tích (3 % khối lượng). Quan sát ngay lập tức và sau 5 s xem có sự hình thành bọt khí oxy hay không.

A.3.4  Từ một khuẩn lạc

Nhỏ riêng hai giọt dung dịch hydrogen peroxid 10 thể tích trên một lam kính.

Chọn một khuẩn lạc bằng que cấy vô khuẩn (bằng thủy tinh hay nhựa) và nhũ hóa nhẹ nhàng nó vào một trong hai giọt. Quan sát ngay sau đó và trong vài min (ít nhất 1 min) có hay không các bọt khí oxy. Trong trường hợp có nghi ngờ, phủ mỗi giọt với một la men và so sánh sự xuất hiện của bọt khí bên dưới hai la men.

Có thể quan sát bằng mắt thường hoặc sử dụng một kính hiển vi có độ phóng đại thấp.

A.4  Phản ứng oxidase

A.4.1  Quy định chung

...

...

...

A.4.2  Thuốc thử

A.4.2.1  Thành phần

N,N,N',N'-Tetramethyl-3-p-phenylenediamine dihydrochloride (C₁₀H₁₆N₂.2HCl)

1,0 g

Nước

100 ml

A.4.2.2  Chuẩn bị

Hoà tan thành phần thuốc thử trong nước lạnh. Chuẩn bị thuốc thử ngay trước khi sử dụng.

Có thể sử dụng đĩa hoặc que thử có sẵn. Trong trường hợp này, thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

...

...

...

Làm ướt một miếng giấy lọc bằng thuốc thử. Lấy mẫu vi khuẩn thu được từ môi trường thạch bằng que cấy bạch kim hoặc thủy tinh hoặc nhựa (một dây niken/chrome cho kết quả dương tính giả) và đặt nó lên giấy lọc ẩm.

A.4.2.4  Giải thích kết quả

Trong trường hợp có sự hiện diện của oxidase, màu tím đến tím đỏ xuất hiện trong khoảng thời gian từ 5 s đến 10 s. Nếu màu sắc không thay đổi sau 10 s, thử nghiệm được xem là âm tính.

A.5  Sử dụng bộ kit thử sinh hóa để nhận biết

Các KIT sinh hóa hiện có thể được sử dụng để định danh. Tuy nhiên, tất cả các KIT thương mại hóa đều không có cùng độ tin cậy. Do đó, nên đánh giá hiệu quả của chúng trước khi sử dụng, trừ khi chúng đã được xác nhận bởi nhà sản xuất và / hoặc một tổ chức độc lập.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Các kỹ thuật đếm và cấy trải cơ bản

...

...

...

Chuẩn bị môi trường, các đĩa Petri, dung dịch pha loãng và mẫu pha loãng phải được kiểm tra số lượng tương ứng với kế hoạch sử dụng.

Lấy một lượng thể tích xác định của các mẫu pha loãng cần kiểm tra vào các đĩa Petri (đã dán nhãn). Đổ vào một lượng môi trường theo quy định trong mục 9.7 vào mỗi đĩa petri. Ngay lập tức lắc cẩn thận để tạo sự phân bố đồng nhất của vi sinh vật trong môi trường. Làm mát và đông đặc môi trường bằng cách đặt các đĩa Petri lên bề mặt mát (thời gian đông đặc của thạch không được vượt quá 10 min).

B.2  Phương pháp cấy trải

Cho các dung dịch cần cấy vào giữa đĩa Petri có chứa môi trường thạch đã dán nhãn (được chuẩn bị theo mục 9.7). Trải đều và nhanh nhất có thể trên bề mặt môi trường bằng cách sử dụng que trải thủy tinh hoặc nhựa dẻo vô khuẩn hoặc xoay đĩa cho đến khi không còn chất lỏng có thể nhìn thấy trên bề mặt thạch.

B.3  Phương pháp lọc qua màng

Chuyển một lượng mẫu phù hợp được chuẩn bị theo hướng dẫn của mỗi phương pháp vào dụng cụ lọc được làm ướt với một lượng nhỏ dung dịch pha loãng vô khuẩn thích hợp, lọc ngay lập tức và rửa theo quy trình thích hợp.

Chuyển màng lọc lên bề mặt môi trường thạch của đĩa petri.

Phụ lục C

...

...

...

Chuẩn bị và hiệu chỉnh hỗn dịch chủng vi sinh vật

C.1  Nuôi cấy các chủng chuẩn

Để tăng độ lặp lại và độ tái lặp của các kết quả, nên sử dụng chủng vi sinh vật thế hệ thứ ba (ít nhất là thế hệ thứ hai) được nuôi cấy trên môi trường thạch, thu được từ các môi trường nuôi cấy và chuẩn bị theo EN 12353. Khi sử dụng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, hỗn dịch thu được sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 18 h đến 24 h. Khi sử dụng Candida albicans, nuôi cấy lần đầu hoặc lần hai, ủ trong khoảng từ 36 h đến 48 h là phù hợp.

C.2  Chuẩn bị các hỗn dịch chủng vi sinh vật

Lấy 10 ml chất pha loãng cho vào bình 100 ml vô khuẩn có chứa 5 g hạt thủy tinh. Dùng que cấy vòng thu sinh khối từ môi trường thạch vào dung dịch pha loãng. Nhúng vòng cấy trong chất pha loãng và chà xát nó vào cạnh bình để giải phóng các tế bào. Lắc bình từ 2 min đến 3 min (sử dụng máy lắc cơ học nếu có thể). Hút phần hỗn dịch phía trên (tránh tiếp xúc với hạt thủy tinh) và chuyển vào trong một bình chứa đã vô khuẩn.

C.3  Hiệu chỉnh các hỗn dịch

Điều chỉnh nồng độ tế bào trong hỗn dịch từ 1 x 10⁸ CFU/ ml đến 3 x 10⁸ CFU/ml (với C. albicans từ 1 x 10⁷ CFU/ml đến 3 x 10⁷ CFU/ml) bằng dung dịch pha loãng và theo dữ liệu hiệu chuẩn trong phòng thử nghiệm. Ví dụ, sử dụng máy quang phổ (bước sóng 620 nm ± 20 nm, bước sóng) và cuvet dùng một lần dài 10 mm. Đo độ hấp thu của một phần hỗn dịch nếu cần pha loãng hỗn dịch để độ hấp thụ nằm trong một giá trị xác định. Các giá trị mật độ quang phổ thích hợp được nằm trong khoảng từ 0,150 đến 0,460 tùy theo từng chủng.

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations

[3] ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water - Preparation, production, storage and performance testing of culture media

[4] ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

[5] EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics. Preservation of test organisms used for the determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal (including bacteriophages) activity

[6] CTFA, Microbiology Guidelines Toiletry and Fragrance Association, iSBN 1-88261-32-8, 2001

[7] EP, Microbiological Examination of non-sterile products, European Pharmacopoeia, Fourth Edition, 2002

[8] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, U.S. Food and Drug Administration, 1995.

[9] JP 1 4, General Tests - Microbial Limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001

[10] JCIA, Microbial test methods for cosmetics, published by the Japanese Cosmetics Industry Association, 1997

...

...

...

Mục lục

Lời nói đầu

Lời giới thiệu

1  Phạm vi áp dụng

2  Tài liệu viện dẫn

3  Thuật ngữ và định nghĩa

3.1  Sản phẩm (product)

3.2  Mẫu (sample)

...

...

...

3.4  Mẫu pha loãng (sample dilution)

4  Phòng thử nghiệm

4.1  Khu vực thử nghiệm

4.2  Các khu vực phụ trợ

4.3  Vị trí phòng thử nghiệm

4.4  Trang thiết bị của phòng thử nghiệm

4.5  Bảo trì

5  Thiết bị

5.1  Quy định chung

...

...

...

5.3  Cân

5.4  Thiết bị đồng nhất

5.5  Máy đo pH

5.6  Nồi hấp

5.7  Tủ ấm

5.8  Bể ổn nhiệt

5.9  Tủ lạnh hoặc phòng bảo quản lạnh

5.10  Tủ đông

5.11  Tủ sấy tiệt khuẩn

...

...

...

5.13  Các thiết bị khác

6  Chủng vi sinh vật

7  Nhân sự

7.1  Năng lực

7.2  Vệ sinh

8  Chuẩn bị dụng cụ và dụng cụ thủy tinh

8.1  Chuẩn bị

8.2  Tiệt khuẩn

8.3  Dụng cụ sử dụng một lần

...

...

...

8.5  Bảo quản dụng cụ và dụng cụ thủy tinh vô khuẩn

8.6  Xử lý vật liệu nhiễm vi sinh vật

8.7  Rửa

9  Chuẩn bị và tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy và thuốc thử

9.1  Quy định chung

9.2  Nước

9.3  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

9.4  Tiệt khuẩn

9.5  Bảo quản

...

...

...

9.7  Chuẩn bị đĩa Petri

10  Mẫu phòng thí nghiệm

10.1  Quy định chung

10.2  Lấy mẫu sản phẩm mỹ phẩm

10.3  Vận chuyển

10.4  Tiếp nhận và bảo quản

10.5  Xử lý sản phẩm và mẫu

10.6  Lưu và hủy các sản phẩm

11  Thực hành vi sinh

...

...

...

11.2  Chuẩn bị hỗn dịch ban đầu và các mẫu pha loãng

11.3  Phương pháp đếm

11.4  Phương pháp phát hiện

12  Biểu thị kết quả

13  Trung hòa tính kháng vi sinh vật của sản phẩm

Phụ lục A (Tham khảo)_Các kỹ thuật định danh cơ bản

Phụ lục B (Tham khảo)_Các kỹ thuật đếm và cấy trải cơ bản

Phụ lục C (Tham khảo)_Chuẩn bị và hiệu chỉnh hỗn dịch chủng vi sinh vật

Thư mục tài liệu tham khảo

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13637:2023 (ISO 21148:2017) về Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Hướng dẫn chung về kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật