5.2.2.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan polysorbate 20 trong 960 ml nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng trong bể cách thủy ở 49 °C ± 2 °C. Thêm casein thủy phân bởi pancreatin và lecithin đậu tương. Đun nóng khoảng 30 min để tan hoàn toàn. Phân phối môi trường vào bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

5.2.2.2  Dung dịch pha loãng có chất trung hòa khác

Các dung dịch pha loãng có chất trung hòa khác có thể được sử dụng thích hựp (xem Phụ lục A và Phụ lục D).

5.2.3  Dung dịch pha loãng

5.2.3.1  Dung dịch A

5.2.3.1.1  Thành phần

Pepton từ mô động vật

1,0 g

...

...

...

Nước

1 000 ml

5.2.3.1.2  Chuẩn bị

Hoà tan 1 g pepton vào 1 000 ml nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình chứa có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,1 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

5.2.3.2  Dịch pha loãng khác

Các dịch pha loãng khác có thể được sử dụng thích hợp (xem Phụ lục B).

5.3  Dung dịch pha loãng cho hỗn dịch nấm men (Dung dịch Natri tryptone chlorid)

5.3.1  Thành phần

...

...

...

1,0 g

Natri clorua

8.5 g

Nước

1 000 ml

5.3.2  Chuẩn bị

...

...

...

5.4  Môi trường nuôi cấy

5.4.1  Yêu cầu chung

Môi trường nuôi cấy có thể được chuẩn bị như sau, hoặc chuẩn bị từ môi trường khô theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Môi trường pha sẵn có thể được sử dụng khi các thành phần và / hoặc hiệu suất sinh trưởng của chúng tương đương với các công thức được đưa ra ở đây.

5.4.2  Môi trường thạch sabouraud dextrose chloramphenicol (SDCA)

Dextrose

40,0 g

Pepton từ mô động vật

5,0 g

...

...

...

Casein thủy phân bởi pancreatin

5,0 g

Chloramphenicol

0,05 g

Thạch

15,0 g

...

...

...

1 000ml

5.4.2.1  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần (bao gồm chloramphenicol) hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

LƯU Ý: Đối với các sản phẩm đã biết là không có khả năng tạp nhiễm (vi khuẩn), sử dụng môi trường không chứa kháng sinh chloramphenicol.

5.4.3  Các môi trường nuôi cấy khác

Có thể sử dụng môi trường thích hợp khác (xem Phụ lục C).

5.4.4  Môi trường thạch để nuôi cấy chủng vi sinh vật chuẩn: Môi trường thạch Sabouraud dextrose (SDA)

5.4.4.1  Thành phần

...

...

...

40,0 g

Pepton từ mô động vật

5,0 g

Casein thủy phân bởi pancreatin

5,0 g

Chloramphenicol

...

...

...

Thạch

15,0 g

Nước

1 000ml

5.4.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

Sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm, thiết bị và dụng cụ thủy tinh được mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148).

7  Chủng vi sinh vật

Để xác nhận hiệu quả của chất trung hòa, sử dụng chủng nấm men sau:

— Candida albicans ATCC[1]⁾ 10231 hoặc chủng tương đương: CIP[2]⁾ 48.72 hoặc NCPF[3]⁾ 3179 hoặc NBRC[4]⁾ 1594 hoặc KCTC[5]⁾ 17205 hoặc TISTR[6]⁾ 5779 hoặc các chủng tương đương trong bộ sưu tập chủng giống quốc gia khác.

Các chủng nấm men được lựa chọn đang được xem là có độ nhạy cảm với hoạt tính kháng nấm hơn là nấm mốc và được chấp nhận như là loài đại diện cho nhóm nấm để thực hiện phép thử xác định sự phù hợp của phương pháp. Tuy nhiên trong trường hợp đặc biệt, trong TCVN/ISO có hướng dẫn về lựa chọn chủng nấm mốc và sử dụng quy trình phù hợp để tạo thành một hỗn dịch chủng đối chứng (ví dụ xem EN13624:2013, mục 5.4.1.4).

Các chủng trên cần được hoàn nguyên theo quy trình hướng dẫn của nhà cung cấp.

Các chủng có thể được lưu giữ trong phòng thí nghiệm theo (EN 12353).

8  Xử lý sản phẩm mỹ phẩm và mẫu thử phòng thí nghiệm

Nếu cần thiết, giữ sản phẩm thử nghiệm ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

Mẫu thử của các sản phẩm mỹ phẩm chuẩn bị để phân tích nên được tiến hành như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148). Mẫu phân tích như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148) và theo quy trình đưa ra trong Điều 9.

9  Cách tiến hành

9.1  Khuyến cáo chung

Sử dụng vật liệu vô khuẩn, thiết bị và kỹ thuật vô khuẩn để chuẩn bị mẫu thử nghiệm, hỗn dịch mẫu ban đầu và các dung dịch pha loãng. Khi chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu, khoảng thời gian từ lúc hoàn tất việc chuẩn bị đến lúc hỗn dịch mẫu ban đầu và / hoặc mẫu pha loãng bắt đầu tiếp xúc với môi trường nuôi cấy không nên quá 45 min, trừ khi có yêu cầu đặc biệt khác trong quy trình hoặc tài liệu đã thiết lập.

9.2  Chuẩn bị hỗn dịch ban đầu

9.2.1  Quy định chung

Hỗn dịch mẫu ban đầu được chuẩn bị từ ít nhất 1 g hoặc 1 ml sản phẩm được trộn đều dưới điều kiện thử nghiệm.

CHÚ THÍCH: S, khối lượng hay thể tích chính xác của mẫu thử nghiệm.

Hỗn dịch mẫu ban đầu thường có độ pha loãng 1:10. Lượng dung dịch pha loãng hoặc môi trường lớn hơn có thể được sử dụng nếu mẫu có nguy cơ nhiễm vi sinh vật cao và / hoặc nếu hoạt tính kháng khuẩn vẫn còn ở độ pha loãng 1:10.

...

...

...

Chuyển lượng mẫu, S, của sản phẩm vào một thể tích phù hợp (ví dụ 9 ml) của dung dịch pha loãng trung hòa (5.2.2) hoặc dung dịch pha loãng (5.2.3).

CHÚ THÍCH: d là hệ số pha loãng.

9.2.3  Các sản phẩm không trộn lẫn được trong nước

Chuyển lượng mẫu, S, của sản phẩm vào trong một bình chứa phù hợp với một lượng thích hợp tác nhân phân tán (ví dụ polysorbat 80). Phân tán mẫu thử trong tác nhân hòa tan và thêm một thể tích (ví dụ 9 ml) dung dịch pha loãng trung hòa (5.2.2) hoặc dung dịch pha loãng (5.2.3).

CHÚ THÍCH: d là hệ số pha loãng

9.3  Phương pháp đếm

9.3.1  Pha loãng cho phương pháp đếm

Hỗn dịch mẫu ban đầu được tính là độ pha loãng đầu tiên. Nếu cần thiết, có thể thực hiện một dãy pha loãng tiếp theo (ví dụ 1:10) từ hỗn dịch mẫu ban đầu, sử dụng cùng một chất pha loãng (tùy theo mức độ tạp nhiễm dự kiến của sản phẩm).

Thông thường, thực hiện đếm khuẩn lạc trên ít nhất hai đĩa petri cho cùng một hệ số pha loãng. Nhưng có thể sử dụng một đĩa Petri trong trường hợp kiểm tra thường xuyên hoặc nếu phương pháp đếm được thực hiện trên các độ pha loãng liên tiếp của cùng một mẫu hoặc dựa theo các kết quả trước đó.

...

...

...

9.3.2.1  Phương pháp đổ đĩa thạch

Chuyển 1 ml hỗn dịch chủng ban đầu và / hoặc mẫu pha loãng đã được chuẩn bị như phần thẩm định vào các đĩa petri có đường kính từ 85 mm đến 100 mm (Điều 12), thêm vào mỗi đĩa từ 15 ml đến 20 ml môi trường thạch đã được làm nóng chảy và giữ trong bể ổn nhiệt không quá 48 °C. Nếu sử dụng các đĩa petri lớn hơn, lượng môi trường thạch cần tăng lên tương ứng.

Trộn hỗn dịch mẫu ban đầu và / hoặc dịch pha loãng mẫu với môi trường cẩn thận bằng cách xoay hoặc nghiêng các đĩa để phân tán đều. Để các đĩa trên bề mặt nằm ngang, hỗn hợp trong đĩa đông lại ở nhiệt độ phòng.

9.3.2.2  Phương pháp cấy trải

Trong các đĩa petri có đường kính từ 85 mm đến 100 mm, cho 15 ml đến 20 ml môi trường thạch đã được làm nóng chảy (5.4.2) và giữ trong bể ổn nhiệt không quá 48 °C. Nếu sử dụng các đĩa Petri lớn hơn, thể tích môi trường tăng lên tương ứng.

Để nguội và làm đông các đĩa trong tủ an toàn sinh học hoặc tủ ủ. Cấy trải lên bề mặt đĩa thạch một thể tích xác định không ít hơn 0,1 ml một lượng của hỗn dịch mẫu ban đầu và / hoặc mẫu pha loãng đã được chuẩn bị như mô tả tại Điều 12.

9.3.2.3  Phương pháp màng lọc

Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ không lớn hơn 0,45 µm.

Chuyển một lượng hỗn dịch mẫu ban đầu hoặc mẫu pha loãng thích hợp (đại diện ít nhất 1 g hoặc 1 ml sản phẩm) lên màng.

...

...

...

Chuyển màng lọc lên bề mặt môi trường thạch (5.4.2).

9.3.2.4  Ủ mẫu

Trừ khi có quy định khác, lật ngược các đĩa đã có mẫu và đặt chúng vào trong tủ ấm ở 22,5 °C ± 2,5 °C trong 3 đến 5 ngày hoặc sử dụng điều kiện thay thế (xem chú thích 4.2 và 4.3). Sau khi ủ, các đĩa phải được kiểm tra ngay nếu có thể. Nếu không có quy định khác có thể bảo quản các đĩa này trong tủ lạnh ở 5 °C ± 3 °C tối đa là 24 h.

CHÚ THÍCH 1. Trong một số trường hợp nhất định, khi có khả năng gây nhầm lẫn trong việc đếm khuẩn lạc với các tiểu phân từ sản phẩm, có thể chuẩn bị các đĩa tương tự về độ pha loãng mẫu và môi trường thạch và được bảo quản trong tủ lạnh để so sánh với các đĩa đem ủ.

CHÚ THÍCH 2: Nếu nghi ngờ có cả nấm mốc và nấm men, cần đọc kết quả ở các thời điểm trung gian (mà không cần phải đợi đủ 3 đến 5 ngày).

10  Đếm khuẩn lạc (phương pháp đếm trên đĩa và phương pháp màng lọc)

Sau khi ủ, đếm khuẩn lạc.

- Trong các đĩa Petri chứa 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc; nếu có ít hơn 15 khuẩn lạc (11.2.3).

- Trên màng lọc chứa 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc; nếu có ít hơn 15 khuẩn lạc (11.2.3).

...

...

...

11.1  Phương pháp tính toán kết quả cho phương pháp đĩa thạch.

Tính số N của các vi sinh vật có trong mẫu s, bằng cách sử dụng

- m, là số khuẩn lạc trung bình đếm trên hai đĩa cùng nồng độ tính theo Công thức (1);

- c, là số khuẩn lạc đếm trên một đĩa tính theo Công thức (2);

- , là số trung bình đã cân chỉnh từ hai độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc phù hợp tính theo công thức (3).

N = m / (V x d)

(1)

N = c / (V x d)

(2)

...

...

...

(3)

Trong đó:

m

là số khuẩn lạc trung bình đếm được từ hai đĩa có cùng nồng độ;

V

là thể tích của mẫu sau pha loãng vào mỗi đĩa, tính bằng ml;

...

...

...

là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng ở bước chuẩn bị hỗn dịch ban đầu (9.2) hoặc cho độ pha loãng lần đầu tiên;

c

là số khuẩn lạc đếm trên một đĩa đơn.

 là trung bình đã cân chỉnh từ hai độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc phù hợp được tính như sau:

Trong đó:

∑c

là tổng các khuẩn lạc đếm trên tất cả các đĩa từ hai độ pha loãng liên tiếp;

...

...

...

n₁

là số lượng đĩa đếm được từ hỗn dịch mẫu ban đầu (hoặc đối với lần pha loãng đầu tiên);

n₂

là số lượng các đĩa được tính độ pha loãng 1/10 của hỗn dịch mẫu ban đầu (hoặc cho lần pha loãng thứ hai).

Kết quả được làm tròn đến 2 chữ số có nghĩa. Khi số cần làm tròn nhỏ hơn 5 thì số đứng trước nó sẽ không phải thay đổi, khi số cuối cùng là 5 hoặc lớn hơn thì làm tròn số đứng ngay trước nó lên 1 đơn vị, tiếp tục cho đến khi thu được 2 chữ số có nghĩa. Ghi lại số N thu được.

11.2  Diễn giải kết quả

11.2.1  Cần xác định độ sai lệch trong phương pháp đếm đĩa.

Hai kết quả được coi là khác nhau khi có sự khác biệt trên 50 % hoặc, khi được thể hiện bằng log thì sự khác biệt vượt quá 0,3.

...

...

...

11.2.2  Trường hợp các đĩa có trên 15 khuẩn lạc và dưới 150 khuẩn lạc trên đĩa hoặc trên màng, biểu thị kết quả như sau:

- Nếu S ít nhất là 1 g hoặc 1 ml, và V là ít nhất 1 ml. Số lượng nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu = N / S.

- Nếu S dưới 1 g hoặc 1 ml, và / hoặc V ít hơn 1 ml. Số lượng nấm men và nấm mốc trong mẫu (lưu ý lượng mẫu đem thử, được coi là S và V) là = N.

Trong đó S là khối lượng hoặc là thể tích của mẫu thử.

Biểu diễn kết quả dưới dạng số giữa 1,0 và 9,9 nhân lên theo cấp số 10 (xem ví dụ).

11.2.3  Trường hợp các đĩa có dưới 15 khuẩn lạc trên đĩa hoặc trên màng lọc, biểu thị kết quả như sau:

- Nếu S ít nhất là 1 g hoặc 1 ml, và V là ít nhất 1 ml, ước tính số lượng nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu = N / S.

- Nếu S dưới 1 g hoặc 1 ml, và / hoặc ít hơn 1 ml, ước tính số nấm men và nấm mốc trong mẫu là = N.

Trong đó:

...

...

...

Biểu diễn kết quả dưới dạng số giữa 1,0 và 9,9 nhân lên theo cấp số 10 (xem ví dụ).

11.2.4  Trường hợp không thấy xuất hiện khuẩn lạc, kết quả được báo cáo như sau:

- Ít hơn 1 / d x V x S nấm men và nấm mốc trên mỗi gram hoặc mililít của sản phẩm (S ít nhất 1 g hoặc 1 ml).

- Ít hơn 1 / d x V nấm men và nấm mốc trong mẫu S (lưu ý lượng mẫu được thử, được coi là S và V và S ít hơn 1 g hoặc 1 ml).

Trong đó:

d là hệ số pha loãng của hỗn dịch mẫu ban đầu (xem 9.2).

V là 1 (đếm bằng phương pháp đổ đĩa thạch và lọc qua màng) hoặc 0,1 (đối với phương pháp cấy trải) (xem ví dụ).

VÍ DỤ 1: Một độ pha loãng cấy lên hai đĩa

S = 1 g ; V = 1; Số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10^-1 là 38 CFU và 42 CFU.

...

...

...

N = m/(V x d) = 40 / (1 x 10^-1) = 40 / (1 x 0,1) = 400 hoặc 4 x 10² tế bào nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu.

VÍ DỤ 2: Một độ pha loãng cấy lên một đĩa

S = 1g, V = 1, Số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10^-1 là 60 CFU.

Nhập vào công thức (2):

N = c / (V x d) = 60/(1 x 10^-1) = 60 / (1 x 0,1) = 600 hoặc 6 x 10² tế bào nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu.

VÍ DỤ 3: Hai độ pha loãng cấy lên 2 đĩa

S = 1 g, V = 1, Số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10^-2 là 235 CFU và 282 CFU; độ pha loãng 10^-3 là 31 CFU và 39 CFU.

Nhập vào công thức (3):

 = /(V x d) =( 235 + 282 + 31 + 39) / [(2 + 0,1 x 2) x (1 x 10^-2)]= 587 / 0,022 = 26682.

...

...

...

VÍ DỤ 4: Một độ pha loãng cấy lên hai màng lọc

S = 1 g; V = 1; Số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10^-1 là 18 CFU và 22 CFU.

Nhập vào công thức (1):

N = m / (V x d)= 20 / (1 x 10^-1) = 20 / (1 x 0,1) = 200 hoặc 2 x 10² tế bào nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu.

VÍ DỤ 5: Một độ pha loãng cấy lên một màng lọc

S = 1 g; V = 1; Số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10^-1 là 65 CFU.

Nhập vào công thức (2):

N = c / (V x d ) = 65 / (1 x 10^-1) = 65 / 0,1 = 650 hoặc 6,5 x 10² tế bào nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu.

VÍ DỤ 6: Hai độ pha loãng cấy lên hai màng lọc

...

...

...

Nhập vào công thức (3):

= 121 + 105 + 15 + 25 /[(2 + 0,1 x 2) x (1 x 10^-1)] = 266 / 0,22 = 1209.

Làm tròn kết quả như đã nêu ở trên cho phép 1200 hoặc 1,2 x 10³ nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu.

VÍ DỤ 7: Một độ pha loãng cấy lên hai đĩa

S = 1 g; V = 1, Số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10^-1 là 28 CFU và 22 CFU.

Nhập vào công thức (1):

N = m / (V x d) = 25 / (1 x 10^-1) = 25/(1 x 0,1) = 250.

Con số ước tính là 250 hoặc 2,5 x 10² nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu.

VÍ DỤ 8:

...

...

...

Nhập vào công thức (1):

N = ≤ 1 /d.v, S, ≤ (1 / 0,1).1,1 ≤ 10 tế bào nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu.

Con số ước tính ít hơn 10 nấm men và nấm mốc trên mỗi mililit hoặc trên một gram mẫu.

12  Trung hòa chất kháng nấm trong sản phẩm

12.1  Quy định chung

Các thử nghiệm khác nhau được mô tả dưới đây nhằm chứng minh các vi sinh vật có thể phát triển trong điều kiện phân tích.

12.2  Chuẩn bị nuôi cấy

Trước khi thử nghiệm, nuôi cấy bề mặt Candida albicans trên môi trường thạch không chọn lọc - Sabouraud dextrose agar (SDA). Ủ ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 18 h đến 24 h.

Để gặt chủng, dùng một que cấy vô khuẩn lấy khuẩn lạc trên bề mặt môi trường sau nuôi cấy ở trên và cho vào dịch pha loãng (5.2) để tạo ra hỗn dịch chủng có nồng độ tế bào vào khoảng 1x10⁶ CFU/ml (ví dụ xác định nồng độ bằng máy quang phổ trong TCVN 13637 (ISO 21148).

...

...

...

12.3  Tính phù hợp của phương pháp đếm trên đĩa thạch

12.3.1  Nguyên tắc

Trộn với mẫu đã trung hòa (hỗn dịch mẫu ban đầu, hoặc mẫu pha loãng tùy theo hoạt tính kháng nấm hoặc khả năng hòa tan kém của sản phẩm) với chủng chuẩn đã pha loãng. Chuyển lên đĩa Petri hoặc lọc qua màng lọc. Sau khi ủ, kiểm tra đếm khuẩn lạc và so sánh với đĩa kiểm tra dương tính (không có mẫu thử).

Nếu số lượng đếm được ít hơn 50 % (0,3 log) so với đối chứng, cần phải thay đổi quy trình để loại bỏ các chất ức chế (pha loãng, dùng các chất trung hòa hoặc kết hợp cả hai, xem phụ lục D). Thử nghiệm được xem như không có giá trị khi vi sinh vật cấy vào không mọc, trừ khi sản phẩm không thể nhiễm bởi vi sinh vật này.

12.3.2  Thử nghiệm xác định tính phù hợp của phương pháp đổ đĩa thạch

Trộn 9 ml hỗn dịch mẫu ban đầu và / hoặc mẫu pha loãng trong dung dịch pha loãng có chất trung hòa (hoặc các dung dịch pha loãng khác, xem 5.2) với 1 ml hỗn dịch vi sinh vật có nồng độ 1 000 CFU/ml đến 3 000 CFU/ml. Chuyển 1 ml hỗn dịch trên vào đĩa petri (tốt nhất là lặp lại trên 2 đĩa), thêm vào mỗi dĩa 15 ml đến 20 ml môi trường đã được đun chảy (5.4.2) và giữ trong bể ổn nhiệt không quá 48 °C. Tiến hành song song đĩa kiểm tra dương tính sử dụng cùng chất pha loãng và bổ sung một lượng hỗn dịch vi sinh vật tương tự, nhưng không có mẫu.

Sau khi ủ 3 ngày đến 5 ngày ở nhiệt độ 22,5 °C ± 2,5 °C, hoặc sử dụng điều kiện thay thế (xem CHÚ THÍCH trong 4.2 và 4.3), đếm khuẩn lạc trên các đĩa và so sánh khuẩn lạc thu được từ mẫu thử và mẫu kiểm tra dương tính. Phương pháp pha loãng và đếm được chấp nhận tại độ pha loãng 1:10 (khi 1ml hỗn dịch mẫu ban đầu được sử dụng) nếu mẫu thử tính phù hợp đạt 50 % (0,3 log) so với mẫu kiểm tra dương tính.

12.3.3  Thử nghiệm xác định tính phù hợp của phương pháp cấy trải

Trộn 9 ml hỗn dịch mẫu ban đầu trong dung dịch pha loãng có chất trung hòa (hoặc dung dịch khác, xem 5.2) với 1 ml hỗn dịch vi sinh vật có chứa 10 000 CFU/ml đến 30 000 CFU/ml (hoặc thấp hơn nếu trải 0,5 ml hoặc 1 ml). Trải ít nhất 0,1 ml vào một đĩa thạch đã đông cứng (5.4.2) (tốt nhất là lặp lại trên 2 đĩa). Tiến hành song song với đĩa kiểm tra dương tính sử dụng cùng chất pha loãng và bổ sung một lượng hỗn dịch vi sinh vật tương tự, nhưng không có mẫu.

...

...

...

12.3.4  Thử nghiệm xác định tính phù hợp của phương pháp màng lọc

Trộn một thể tích hỗn dịch mẫu ban đầu hoặc mẫu đã pha loãng (9.3.2.3) với một lượng phù hợp của một hỗn dịch vi sinh vật đã chuẩn hóa tương ứng với khoảng 100 CFU.

Lọc ngay toàn bộ thể tích và rửa màng với một thể tích xác định của nước (5.1), dung dịch pha loãng (5.2.3) hoặc dung dịch pha loãng có chất trung hòa (5.2.2). Chuyển màng lên bề mặt môi trường thạch thích hợp (5.4.2).

Tiến hành song song với mẫu kiểm tra dương tính trong cùng điều kiện như trên, nhưng không có sản phẩm. Lọc và rửa mẫu kiểm tra dương tính như mẫu thử.

Sau khi ủ 3 ngày đến 5 ngày ở nhiệt độ 22,5 °C ± 2,5 °C hoặc sử dụng điều kiện thay thế (xem CHÚ THÍCH 4.2 và 4.3), đếm các khuẩn lạc trên màng và so sánh số khuẩn lạc thu được từ mẫu thử và mẫu kiểm tra dương tính. Phương pháp màng lọc và chất pha loãng được chấp nhận tại độ pha loãng 1:10 (khi 1 ml hỗn dịch mẫu ban đầu được sử dụng) nếu mẫu thử tính phù hợp đạt 50 % (0,3 log) so với mẫu kiểm tra dương tính.

13  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm bao gồm:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này, nghĩa là TCVN 13633 (ISO 16212:2017); Amendment 1:2022;

b) Tất cả các thông tin cần thiết cho việc nhận diện sản phẩm;

...

...

...

d) Các kết quả đã thu được;

e) Tất cả các chi tiết thực hiện để chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu;

f) Mô tả phương pháp với chất trung hòa và môi trường đã sử dụng;

g) Chứng minh sự phù hợp của phương pháp, ngay cả khi thử nghiệm đã được thực hiện riêng;

h) Bất kỳ điểm nào không được nêu trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn (không bắt buộc), cùng với các chi tiết về bất kỳ sự cố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các dung dịch pha loãng có chất trung hòa khác

...

...

...

Bất cứ dung dịch trung hòa nào được sử dụng để tạo hỗn dịch mẫu ban đầu đều được kiểm tra và thẩm định. Các dung dịch trung hòa sau đây là các ví dụ về các dung dịch phù hợp. Thông tin chung về sự trung hòa được đưa ra ở Phụ lục D.

A.2  Môi trường lỏng Eugon LT100

A.2.1  Yêu cầu chung

Thành phần môi trường có chứa chất các chất trung hòa chất ức chế có trong mẫu (lecithin và polysorbat 80) chất phân tán (octoxynol 9).

A.2.2  Thành phần

Casein thủy phân bởi pancreatin

15,0 g

Pepton đậu tương hoặc Bột đậu tương thủy phân bởi Papaic

...

...

...

L- cystin

0,7 g

Natri clorid

4,0 g

Sodium sulfit

0,2 g

...

...

...

Glucose

5,5 g

Lecithin từ trứng

1,0 g

Polysorbat 80

5,0 g

...

...

...

5,0 g

Nước

1 000 ml

A.2.3  Chuẩn bị

Hòa tan polysorbat 80, octoxynol 9 và lecithin từ trứng vào nước sôi cho đến khi tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần còn lại khác vào bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,0 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

A.3  Dung djch Lecithin polysorbate (LP)

A.3.1  Thành phần

...

...

...

1,0 g

Lecithin từ trứng

0,7 g

Polysorbat 80

20,0 g

Nước

...

...

...

A.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

A.4  Môi trường Eugon LT lỏng cải tiến

A.4.1  Thành phần

Casein thủy phân bởi prancreatin

15,0 g

Bột đậu tương thủy phân bởi papain

...

...

...

L-cystine

0,7 g

Natri clorid

4,0 g

Natri sulfit

0,2 g

...

...

...

Glucose

5,5 g

Lecithin từ trứng

1,0 g

Polysorbat 80

5,0 g

...

...

...

1,56 g

Nước

1 000 ml

A.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan lần lượt từng thành phần polysorbate 80, lecithin từ trứng trong nước sôi để tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần còn lại khác bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng khoảng 7,0 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

Phụ lục B

...

...

...

Các dung dịch pha loãng khác

B.1  Quy định chung

Bất cứ dung dịch nào được sử dụng để tạo ra hỗn dịch mẫu ban đầu đều được kiểm tra và thẩm định. Các dung dịch sau là ví dụ về các dung dịch phù hợp.

B.2  Dung dịch đệm pepton pH 7

B.2.1  Thành phần

Pepton từ thịt

1,0 g

Natri clorid

...

...

...

Mono kali photphat

3,6 g

Dinatri phosphate dihydrat

7,2 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

B.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,1 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

B.3  Đệm photphat (pH 7,2)

B.3.1  Thành phần

Kali dihydrogen phosphat

34 g

Nước

500 ml

...

...

...

B.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước vào bình 1000 ml. Điều chỉnh pH 7,2 ± 0,1 với 175 ml Natri hydroxid (4,3 g/100 ml). Sau đó thêm nước vào để đạt được thể tích cuối cùng là 1000 ml. Nồng độ cuối cùng đạt 0,05 mol/l. Đây là dung dịch gốc. Bảo quản trong tủ lạnh.

Trước khi sử dụng, pha loãng dung dịch này với nước tỷ lệ 1:800 và hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Các môi trường nuôi cấy khác

C.1  Quy định chung

Bất cứ môi trường nuôi cấy nào được sử dụng cũng đã được kiểm tra và thẩm định. Các môi trường dưới đây là ví dụ về các môi trường phù hợp.

...

...

...

C.2.1  Môi trường thạch khoai tây dextrose bổ sung kháng sinh

C.2.1.1  Thành phần

Dịch chiết từ khoai tây

4,0 g

Glucose

20,0 g

Thạch

...

...

...

Chloramphenicol

0,05 g

Nước

1 000 ml

C.2.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

C.2.2  Môi trường Glucose-pepton (GP) có kháng sinh

C.2.2.1  Thành phần

Glucose

20,0 g

Cao nấm men

2,0 g

Magnesi sulfat

...

...

...

Pepton

5,0 g

Monokali phosphat

1.0 g

Thạch

15,0 g

...

...

...

Chloramphenicol

0,05 g

Nước

1 000ml

C.2.2.2  Chuẩn bị

Trộn các thành phần và phân phối vào bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 5,7 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

Có thể thay chloramphenicol bằng 0,10 g Kali benzylpenicillin và 0,10 g tetracillin cho 1 lít môi trường được thêm vào dưới dạng dung dịch vô khuẩn ngay trước khi sử dụng.

...

...

...

C.3.1  Thành phần

Cao nấm men

30,0 g

Pepton đậu tương, bột đậu tương thủy phân bởi papaic

3,0 g

Thạch

15,0 g

...

...

...

Chloramphenicol

0,05 g

Nước

1 000 ml

C.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần (bao gồm cả chloramphenicol) hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 115 °C trong 10 min. Sau khi hấp và làm nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

(Tham khảo)

Các chất trung hòa hoạt tính kháng vi sinh vật của chất bảo quản và các dung dịch rửa/ lọc

Chất bảo quản

Hợp chất hóa học có thể trung hòa hoạt tính kháng khuẩn của chất bảo quản

Ví dụ về thành phần chất trung hòa thích hợp và các dung dịch rửa

(dùng cho phương pháp màng lọc)

Các hợp chất phenol:

Các paraben, phenoxyethanol,

Phenylethanol, v.v...

...

...

...

Lecithin,

Polysorbat 80,

Ethylen oxid ngưng tụ của cồn béo (fatty alcohol)

Chất hoạt động bề mặt không ion

30 g/l Polysorbat 80 + 3 g/l lecithin.

7 g/l Ethylen oxid ngưng tụ của cồn béo + 20 g/l lecithin + 4 g/l polysorbate 80.

Môi trường lỏng trung hòa D/E.

Dung dịch rửa: nước cất vô khuẩn; 1 g/1 trypton, + 9 g/l NaCI; 5 g/l polysorbat 80.

Các hợp chất amoni bậc bốn

...

...

...

Lecithin, saponin, polysorbat 80, natri dodecyl sulphat

Ethylen oxid ngưng tụ của cồn béo (fatty alcohol)

30 g/l Polysorbat 80 + 4 g/l natri dodecyl sulphat + 3 g/1 lecithin.

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin.

Môi trường lỏng trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: 1 g/l trypton, + 9 g/l NaCI; 5 g/l polysorbat 80.

Các andehit

Các chất giải phóng formaldehyd

Glycin, histidin

...

...

...

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 1 g/l L- histidin + 1 g/l L-cystein.

Môi trường lỏng trung hòa D/E.

Dung dịch rửa: 3 g/l polysorbat 80 + 0,5 g/l L- histidin.

Các hợp chất oxy hóa

Natri thiosulfat

5 g/I Natri thiosulfat.

Dung dịch rửa: 3 g/l Natri thiosulfat.

Các isothiazolinon, imidazol

Lecithin, saponin

...

...

...

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin.

Dung dịch rửa: 1 g/l trypton + 9 g/l NaCI; 5 g/l polysorbat 80.

Các biguanide

Lecithin, saponin, polysorbat 80

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin.

Dung dịch rửa: 1 g/l trypton + 9 g/l NaCI; 5 g/l polysorbat 80.

Các muối kim loại (Cu, Zn, Hg)

Các muối thủy ngân hữu cơ

Natri bisulfat, L-cystein

...

...

...

0,5 g/l hay 5 g/l Natri thloglycolat.

0,8 g/l hay 1,5 g/l L-cystein.

Môi trường lỏng trung hòa D/E.

Dung dịch rửa: 0,5 g/l Natri thioglycolat.

GHI CHÚ: Theo pH của sản phẩm mỹ phẩm, pH của chất trung hòa có thể được điều chỉnh tới giá trị phù hợp.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ISO 18415, Cosmetics - Microbiology - Detection of specified and non - specified microorganisms

[2] ISO 18416:2015, Cosmetics - Microbiology - Detection of Candida albicans

...

...

...

[4] COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, European Cosmetics, Toiletry and Perfumery Association, 1997

[5] CTFA, Microbiology Guidelines, Toiletry and Tragrance Association, 2001.

[6] EP, Microbiological Examination of non-sterile products, European Pharmacopoeia, Fourth Edition, 2002

[7] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, U.S. Food and Drug Administration, 1995, http://www.fda.gov/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm2006949.htm

[8] JP 14, General Tests - Microbial Limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001

[9] USP 28, Microbial Limit test (61), U.S. Pharmacopoeia, 2005

[10] ATLAS R.M., Handbook of Microbiological Media, CRC Press, 1993

[11] SINGER S., The Use of Preservative Neutralizers in Diluents and Plating Media, Cosmetics and Toiletries,102, p.55, December, 1987

[12] ISO 29621, Cosmetics - Microbiology - Guidelines for the risk assessment and identification of microbiologically low - risk products

...

...

...

Mục lục

Lời nói đầu

1  Phạm vi áp dụng

2  Tài liệu viện dẫn

3  Thuật ngữ và định nghĩa

3.1  Nấm men (yeast)

3.2  Nấm mốc (mould)

3.3  Sản phẩm (product)

3.4  Mẫu (sample)

...

...

...

3.6  Mẫu pha loãng (sample dilution)

4  Nguyên tắc

4.1  Quy định chung

4.2  Phương pháp đĩa thạch

4.3  Phương pháp màng lọc

5  Dung dịch pha loãng, chất trung hoà và môi trường nuôi cấy

5.1  Quy định chung

5.2  Dung dịch pha loãng có chất trung hòa và dung dịch pha loãng

5.3  Dung dịch pha loãng cho hỗn dịch nấm men (Dung dịch Natri tryptone chlorid)

...

...

...

6  Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

7  Chủng vi sinh vật

8  Xử lý sản phẩm mỹ phẩm và mẫu thử phòng thí nghiệm

9  Cách tiến hành

9.1  Khuyến cáo chung

9.2  Chuẩn bị hỗn dịch ban đầu

9.3  Phương pháp đếm

10  Đếm khuẩn lạc (phương pháp đếm trên đĩa và phương pháp màng lọc)

11  Biểu thị kết quả

...

...

...

11.2  Diễn giải kết quả

12  Trung hòa chất kháng nấm trong sản phẩm

12.1  Quy định chung

12.2  Chuẩn bị nuôi cấy

12.3  Tính phù hợp của phương pháp đếm trên đĩa thạch

13  Báo cáo thử nghiệm

Phụ lục A (Tham khảo) Các dung dịch pha loãng có chất trung hòa khác

Phụ lục B (Tham khảo) Các dung dịch pha loãng khác

Phụ lục C (Tham khảo) Các môi trường nuôi cấy khác

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1]⁾ ATCC = American Type Culture Collection = Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ.

[2]⁾ IP = Bộ sưu tập Viện Pasteur, Pháp.

[3]⁾ NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi = Bộ sưu tập nấm gây bệnh quốc gia, Anh Quốc.

[4]⁾ NBRC = National Biological Resource Center = Trung tâm tài nguyên sinh vật quốc gia, Nhật Bản

[5]⁾ KCTC = Korean Collection for Type Culture = Bộ sưu tập chủng chuẩn Hàn Quốc

[6]⁾ TISTR = Thailand Institute of Scientific and Technological Research = Viện khoa học và nghiên cứu công nghệ Thái lan

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13633:2023 (ISO 16212:2017 with Amendment 1:2022) về Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Định lượng nấm men và nấm mốc