5.3.3.1.3  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần, polysorbate 80, octoxynoi 9 và lecithin trứng lần lượt trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần khác bằng cách trộn trong khi gia nhiệt.

Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương với 7,0 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

5.3.3.2  Các canh thang tăng sinh khác

Các môi trường tăng sinh khác có thể được sử dụng nếu phù hợp (xem Phụ lục A)

5.3.4  Môi trường thạch chọn lọc để phân lập E.coli

5.3.4.1  Môi trường thạch MacConkey

5.3.4.1.1  Thành phần

- casein pancreatic

...

...

...

- bột đậu tương thủy phân bởi papaic

1,5 g

- loại của mô động vật

1,5 g

- lactose

10,0 g

- hỗn hợp muối mật

1,5 g

- natri clorua

...

...

...

- thạch

13,5 g

- đỏ trung tính

30,0 mg

- tím crystal

1,0 mg

- nước

1000 mL

5.3.4.1.2  Chuẩn bị

...

...

...

Rót vào các bình chứa phù hợp và khử trùng tại 121 °C trong 15 min.

Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương với 7,1 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

5.3.5  Môi trường thạch chọn lọc để xác định E.coli

5.3.5.1  Môi trường thạch xanh methylene - levine eosin

5.3.5.1.1  Thành phần

- gelatin pancreatic

10,0 g

- kali hydrophotphat (K₂HPO₄)

2,0 g

...

...

...

15,0 g

- lactose

10,0g

- eosin Y

400 mg

- xanh methylene

65 mg

- nước

1000 mL

...

...

...

Hòa tan gelatin pancreatic, kali hydro photphat và thạch trong nước, cùng với làm ấm và để nguội. Ngay trước khi sử dụng, hóa lỏng dung dịch thạch dạng keo, cho thêm các thành phần khác, như các dung dịch theo lượng sau và trộn; đối với mỗi 100 mL dung dịch thạch hóa lỏng

- 5 mL dung dịch lactose 20 %

- 2 mL dung dịch eosin Y 2 %

- 2 mL dung dịch xanh methylen 0,033 %

Môi trường hoàn thiện có thể không trong.

Rót vào các bình chứa phù hợp và khử trùng tại 121 °C trong 15 min.

Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương với 7,1 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

6  Thiết bị, dụng cụ và đồ thủy tinh

Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm, dụng cụ và đồ thủy tinh theo quy định tại ISO 21148.

...

...

...

Đối với việc kiểm tra xác nhận tính phù hợp của các điều kiện thử nghiệm, các chủng đại diện sau được sử dụng:

E.coli ATCC1) 8739 [chủng tương đương: CIP2) 53.126 hoặc NCIMP3) 8545 hoặc NBRC4) 3972 hoặc KCTC5) 2571 hoặc chủng khác tương đương].

Việc nuôi cấy cần tuân theo các quy trình được cung cấp bởi do nhà cung cấp chủng chuẩn cung cấp. Chủng vi sinh vật có thể được lưu giữ trong phòng thử nghiệm theo EN 12353,^[12]

8  Xử lý các sản phẩm mỹ phẩm và mẫu phòng thử nghiệm

Nếu cần thiết, lưu giữ các sản phẩm được thử nghiệm tại nhiệt đô phòng.

Không ủ, làm lạnh hoặc cấp đông sản phẩm và mẫu trước hoặc sau khi phân tích.

Lấy mẫu các sản phẩm mỹ phẩm sẽ được phân tích cần được thực hiện theo ISO 21148. Phân tích mẫu theo ISO 21148 và theo quy trình ở Điều 9.

9  Cách tiến hành

9.1  Khuyến nghị chung

...

...

...

9.2  Chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu trong canh thang làm giàu

9.2.1  Quy định chung

Làm giàu được chuẩn bị từ mẫu (3.2) của ít nhất 1 g hoặc 1 ml mẫu thử sản phẩm được trộn kỹ theo điều kiện thử nghiệm mà được phân tán trong ít nhất 9 mL canh thang tăng sinh.

Ghi lại chính xác khối lượng hoặc dung tích của mẫu, S.

Phương pháp phải được kiểm tra để đảm bảo rằng thành phần (chất trung hòa đã được thêm vào) và dung tích canh thang thực hiện thỏa đáng (xem 11.3).

CHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp và khi có thể, lọc sản phẩm mỹ phẩm qua màng sau khi ngâm trong canh thang tăng sinh tạo điều kiện cho sự trung hòa các đặc tính kháng khuẩn của sản phẩm (xem 11.3).

9.2.2  Các sản phẩm có thể trộn với nước

Cho mẫu, S, của sản phẩm vào bình chứa phù hợp có chứa dung tích canh thang phù hợp.

9.2.3  Các sản phẩm không trộn được với nước

...

...

...

Phân tán mẫu trong chất hòa tan và bổ sung dung tích canh thang phù hợp.

9.2.4  Các sản phẩm có thể lọc dược

Sử dụng bộ lọc với màng có kích cỡ lỗ danh định không lớn hơn 0,45 μm.

Chuyển mẫu, S, lên trên màng trong thiết bị lọc (xem ISO 21148). Lọc ngay và rửa màng sử dụng lượng nước và/hoặc chất pha loãng xác định.

Chuyển và ngâm màng vào trong ống hoặc bình có kích cỡ phù hợp có chứa lượng canh thang phù hợp.

9.3  Ủ canh thang tăng sinh cấy truyền

Ủ dung dịch huyền phù ban đầu đã được chuẩn bị trong canh thang (xem 9.2) tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong ít nhất 20 h (tối đa 72 h).

9.4  Phát hiện và nhận dạng E.coli

9.4.1  Phân lập

...

...

...

Lật ngược đĩa Petri và sau đó ủ tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong ít nhất 24 h (tối đa 48 h).

Kiểm tra các đặc tính của khuẩn lạc (xem Bảng 1).

Bảng 1 - Hình thái đặc tính của E.coli trên môi trường thạch MacConkey

Môi trường chọn lọc

Hình thái đặc tính của khuẩn lạc E.coli

Môi trường thạch MacConkey

Màu đỏ gạch; có thể có vòng kết tủa xung quanh khuẩn lạc

9.4.2  Nhận dạng E.coli

9.4.2.1  Quy định chung

...

...

...

9.4.2.2  Vết gram

Thực hiện thử nghiệm được xác định trong ISO 21148. Kiểm tra que gram âm (bacilli).

9.4.2.3  Nuôi cấy trên môi trường thạch xanh methylene - levine eosin (môi trường thạch EMB)

Cấy truyền trên bề mặt của môi trường thạch xanh methylene - levine eosin với các khuẩn lạc phân lập nghi ngờ phát triển trên môi trường thạch MacConkey sao cho các khuẩn lạc phân lập phát triển. Lật ngược đĩa Patri và sau đó ủ tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong ít nhất 24 h (tối đa 48 h).

Kiểm tra các đặc tính của khuẩn lạc như được xác định trong Bảng 2.

Bảng 2 - Hình thái đặc tính của E.coli trên môi trường thạch xanh methylene - levine eosin

Môi trường chọn lọc

Hình thái đặc tính của khuẩn lạc E.coli

Môi trường thạch xanh methylene - levine eosin

...

...

...

10  Biểu thị kết quả (phát hiện E.coli)

Nếu việc nhận dạng các khuẩn lạc khẳng định sự có mặt của các chủng này, biểu thị kết quả là:

- “Có E.coli trong mẫu S”

Nếu không quan sát thấy có sự tăng trưởng sau khi làm giàu quan sát hoặc nhận diện các khuẩn lạc không khẳng định sự có mặt của các chủng này, biểu thị kết quả là:

- “Không có E.coli trong mẫu S”

11  Trung hòa hóa các đặc tính kháng khuẩn của sản phẩm

11.1  Quy định chung

Các thử nghiệm khác nhau trong 11.2 đến 11.3 cho thấy rằng vi sinh vật có thể phát triển theo các điều kiện phân tích.

11.2  Chuẩn bị chất để cấy

...

...

...

Để thu hoạch chủng cấy sử dụng que cấy vòng đã tiệt trùng, vệt bề mặt nuôi cấy và cho vào lại trong dung dịch pha loãng (5.2) để nhận được dung dịch huyền phù hiệu chuẩn khoảng 1 x 10⁸ CFU trên mL (ví dụ sử dụng thiết bị đo quang phổ, ISO 21148:2005, Phụ lục C).

Sử dụng dung dịch huyền phù đã được hiệu chuẩn này và dung dịch pha loãng của nó trong 2 h

11.3  Tính phù hợp của phương pháp phát hiện

11.3.1  Cách tiến hành

11.3.1.1  Trong các ống có 9 mL dung dịch pha loãng (5.2), chuẩn bị dung dịch pha loãng của dung dịch huyền phù đã được hiệu chuẩn (11.2) để nhận được lần đếm cuối cùng trong khoảng 100 CFU/mL và 500 CFU/mL. Để đếm nồng độ cuối cùng của các vi sinh vật có thể phát triển trong dung dịch huyền phù đã được hiệu chuẩn pha loãng, cho 1 mL dung dịch huyền phù vào trong đĩa Petri và rót 15 mL đến 20 mL môi trường thạch nóng chảy (5.3.2) được giữ trong bồn cách thủy tại nhiệt độ không lớn hơn 48 °C. Để đông đặc và sau đó ủ tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong 20 h đến 24 h.

11.3.1.2  Chuẩn bị hai dung dịch huyền phù ban đầu giống nhau (9.2) theo các điều kiện đã chọn đối với thử nghiệm (ít nhất 1 g hoặc 1 mL sản phẩm theo thử nghiệm, thể tích xác định của canh thang làm giàu) trong ống hoặc bình. Khi sử dụng phương pháp lọc màng (9.2.4), lọc hai lần mỗi lần ít nhất 1 mL sản phẩm thử nghiệm và cho mỗi màng vào trong ống hoặc bình có chứa canh thang tăng sinh theo các điều kiện được chọn cho thử nghiệm.

11.3.1.3  Đưa vô trùng 0,1 mL dung dịch huyền phù hiệu chuẩn pha loãng vô trùng các vi sinh vật vào một ống hoặc bình (phép thử thích hợp). Trộn sau đó ủ cả ống hoặc bình (thử nghiệm tính phù hợp và kiểm soát không cấy truyền) tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong 20 h đến 24 h.

11.3.1.4  Thực hiện phân lập đối với mỗi ống hoặc bình (phép thử thích hợp và kiểm soát không cấy). Sử dụng que cấy, lấy một vết (cùng các điều kiện như trong thử nghiệm) của hỗn hợp ủ trên bề mặt môi trường thạch MacConkey (xấp xỉ 15 mL đến 20 mL) trong đĩa Petri (đường kính 85 mm đến 100 mm). Ủ đĩa tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong 24 h đến 48 h.

11.3.2  Diễn giải kết quả thử nghiệm tính phù hợp

...

...

...

Tính trung hòa hóa được kiểm tra xác nhận và phương pháp phát hiện đáp ứng yêu cầu nếu đặc tính tăng trưởng của E.coli xảy ra trên đĩa thử nghiệm tính phù hợp và không có sự tăng trưởng xảy ra trên đĩa kiểm soát.

Khi sự tăng trưởng được phát hiện trên đĩa kiểm soát (các sản phẩm nhiễm khuẩn), trung hòa hóa được kiểm tra xác nhận và phương pháp phát hiện đáp ứng yêu cầu nếu E.coli được phục hồi trên đĩa thử nghiệm tính phù hợp.

Không có sự tăng trưởng trên đĩa thử nghiệm tính phù hợp cho thấy hoạt tính kháng vi khuẩn vẫn có mặt và cần chỉnh sửa các điều kiện của phương pháp bằng cách tăng thể tích canh thang, số lượng sản phẩm vẫn giữ như cũ hoặc bằng cách hợp nhất một số lượng đủ chất khử hoạt tính trong canh thang làm giàu hoặc bằng cách kết hợp các sửa đổi phù hợp để cho phép sinh trưởng E.coli.

Nếu mặc dù hợp nhất các chất khử hoạt tính phù hợp và tăng đáng kể thể tích canh thang làm giàu vẫn không thể hồi phục nuôi cấy phát triển như mô tả ở trên, cho thấy gần như không bị nhiễm khuẩn E.coli.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải quy định cụ thể các thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này, nghĩa là TCVN 12974:2020 (ISO 21150:2015);

b) Tất cả thông tin cần thiết để nhận dạng hoàn toàn sản phẩm;

c) Phương pháp sử dụng;

...

...

...

e) Tất cả chi tiết hoạt động đối với chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu;

f) Mô tả phương pháp sử dụng chất trung hòa và môi trường;

g) Chứng minh tính phù hợp của phương pháp, thậm chí nếu thử nghiệm đã được thực hiện tách biệt;

h) Bất kỳ điểm nào không quy định trong tài liệu này hoặc được coi là tùy chọn cùng với các chi tiết của bất kỳ sự cố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Các canh thang tăng sinh khác

A.1  Môi trường lactose lỏng có chất trung hòa và phân tán

...

...

...

- trung hòa các chất ức chế có trong mẫu: lecithin và polysorbate 80 và

- chất phân tán: octoxynol 9

A.1.1  Thành phần

- cao thịt bò

3,0 g

- gelatin pancreatic

5,0 g

- lactose

5,0 g

...

...

...

1,0 g

- polysorbate 80

5,0 g

- octoxynol 9

1,0 g

- nước

1000 mL

A.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần, polysorbate 80, octoxynol 9 và lecithin trứng, lần lượt trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần khác bằng cách trộn trong khi gia nhiệt. Phân tán môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Để nguội môi trường càng nhanh càng tốt sau khi khử trùng. Độ pH phải tương đương 6,9 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

...

...

...

A.2.1  Thành phần

- cao thịt bò

3,0 g

- gelatin pancreatic

5,0 g

- lactose

5,0 g

- nước

1000 mL

...

...

...

Hòa tan các thành phần trong nước. Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121°C trong 15 min. Để nguội môi trường càng nhanh càng tốt sau khi khử trùng. Độ pH phải tương đương 6,9 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

A.3  Môi trường đậu tương - casein - loại - lecithin - polysorbate 80 (canh thang SCDLP 80)

A.3.1  Thành phần

- casein peptone

17,0g

- đậu tương peptone

3,0 g

- natri clorua

5,0 g

...

...

...

2,5 g

- glucose

2,5 g

- lecithin

1,0 g

- polysorbate 80

7,0 g

- nước

1000 mL

...

...

...

Hòa tan tất cả các thành phần hoặc môi trường hoàn toàn khử nước lần lượt trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương 7,2 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

A.4  Canh thang trung hòa D/E (canh thang trung hòa Dey/Engley)

A.4.1  Thành phần

- glucose

10,0 g

- đậu tương lecithin

7,0 g

- natri thiosulfate pentahydrate

6,0 g

...

...

...

5,0 g

- casein pancreatic

5,0 g

- natri bisulfite

2,5 g

- cao men bia

2,5 g

- natri thioglycolate

1,0 g

...

...

...

0,02 g

- nước

1000 mL

A.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan tất cả các thành phần hoặc môi trường hoàn toàn khử nước lần lượt trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương 7,6 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

A.5  Canh thang letheen cải biến

A.5.1  Thành phần

- loại phân hủy của thịt

20,0 g

...

...

...

5,0 g

- cao thịt bò

5,0 g

- cao men bìa

2,0 g

- lecithin

0,7 g

- plysorbate 80

5,0 g

...

...

...

5,0 g

- natri bisulfite

0,1 g

- nước

1000 mL

A.5.2  Chuẩn bị

Hòa tan lần lượt polysorbate 80 và lecithin trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần khác bằng cách trộn trong khi gia nhiệt. Trộn nhẹ để tránh tạo bọt. Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương 7,2 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

Phụ lục B

...

...

...

Các chất trung hòa có hoạt tính khử vi khuẩn của chất bảo quản và dung dịch rửa

Chất bảo quản

Hợp chất hóa học có thể trung hòa hoạt tính kháng khuẩn của chất bảo quản

Ví dụ về các chất trung hòa phù hợp và chất lỏng để rửa (đối với các phương pháp lọc màng)

Các hợp chất phenolic: paraben, phenoxyetanol, phenyletanol, v.v.. anilides

Lecithin, polysorbate 80, phần ngưng ethylen oxit của ancol béo, các chất hoạt tính bề mặt không ion

Polysorbate 80, 30 g/L + lecithin, 3 g/L

Phần ngưng ethylen oxit của ancol béo, 7 g/L + lecithin, 20 g/L + polysorbate 80, 4 g/L.

Canh thang trung hòa D/E^a

...

...

...

Các hợp chất ammonium bậc bốn, chất hoạt tính bề mặt cationic

Lecithin, saponin, plysorbate 80, natri dodecyl sulfate,

Phần ngưng ethylene oxit của ancol béo

Polysorbate 80, 30 g/L + natri dodecyl sulfate, 4 g/L + lecithin, 3 g/L

Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, 3 g/L

Canh thang trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: nước cất; tryptorie, 1 g/L + NaCI, 9 g/L; polysorbate 80, 5g/L

Các chất thải aldehyde, formaldehyde

Glycine, histidine

...

...

...

Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + L-histidine, 1 g/L + L-cysteine, 1 g/L

Canh thang trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: polysorbate 80, 3 g/L + L-histidine, 0,5 g/L

Các hợp chất oxy hóa

Natri thiosulfate

Natri thiosulfate, 5 g/L

Dung dịch rửa: Natri thiosulfate, 3 g/L

Các isothiazolinones, imidazoles

Lecithin, saponin,

...

...

...

Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, 3 g/L

Dung dịch rửa: tryptone, 1 g/L + NaCI, 9 g/L; polysorbate 80, 5 g/L

Biguanides

Lecithin, saponin, polyscrbate 80

Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, 3 g/L

Dung dịch rửa: tryptone, 1 g/L + NaCI, 9 g/L; polysorbate 80, 5 g/L

Muối kim loại (Cu, Zn, Hg), các hợp chất hữu cơ - thủy ngân

...

...

...

Các hợp chất sulfhydryl, axit thioglycollic

Natri thioglycollate, 0,5 g/L hoặc 5 g/L

L-cysteine, 0,8 g/L hoặc 1,5 g/L

Canh thang trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: natri thioglycollate, 0,5 g/L

CHÚ THÍCH: Xem tham chiếu [8] và [11]

^a Canh thang trung hòa D/E (canh thang trung hòa Dey/Engley) xem Phụ lục A

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] CTFA. Microbiology guidelines, published by the cosmetic, toiletry and fragrance association ISBN 1-882621-32-8, 2007 (Hướng dẫn về vi sinh vật, Hiệp hội nước, hoa và mỹ phẩm ISBN 1-882621-32-8 xuất bản, 2007)

[3] EP., Microbiological examination of nnn-sterile products, 4th edition, published by the European pharmacopoeia, 2002 (Kiểm tra vi sinh vật của các sản phẩm không khử trùng, xuất bản lần thứ 4 bởi Dược điển Châu Âu, 2002)

[4] FDA. Bacteriological analytical manual, 8th edition, published by the u.s. Food and Drug Administration, 1995, http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23.html (Tài liệu phân tích vi khuẩn, xuất bản lần thứ 8 bởi Cục thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ, 1995, http://www. cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23. html)

[5] JP 14, General tests - Microbial limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001 (Các thử nghiệm chung - Thử nghiệm giới hạn vi khuẩn, xuất bản bởi Dược điển Nhật Bản, 2001)

[6] USP 28, Microbial limit test (61), published by the u.s. Pharmacopoeia, 2005 [Thử nghiệm giới hạn vi khuẩn (61) xuất bản bởi Dược điển Hoa Kỳ, 2005]

[7] ATLAS R.M. Handbook of microbiological media. CRC Press, 1993 (Sách về Môi trường vi sinh vật. CRC Press, 1993)

[8] SINGER S. The use of preservative neutralizers in diluents and plating media. Cosmetics and toiletries. 1987 December, 102 p. 55 (Sử dụng các chất trung hòa bảo quản trong chất làm loãng và môi trường cấy. Mỹ phẩm và nước hoa. Tháng 12 năm 1987, 102 trang 55)

[9] ISO 21149, Cosmetics - Microbiology - Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria (Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Đếm và phát hiện vi khuẩn hiếu khí)

[10] ISO 18415, Cosmetics - Microbiology - Detection of specified and non-specified microorganisms (Mỹ phẩm - Vi sinh vật Phát hiện các vi sinh vật xác định và không xác định)

...

...

...

[12] ISO 29621, Cosmetics - Microbiology - Guidelines for risk assessment and identification of microbiologically low-risk products (Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Hướng dẫn đánh giá rủi ro và nhận dạng các sản phẩm có nguy cơ thấp nhiễm vi sinh vật)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12974:2020 (ISO 21150:2015) về Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Phát hiện E.coli