CHÚ THÍCH: Người sử dụng có thể xác định thể tích chính xác được sử dụng để chuẩn bị cho đến khi nồng độ cuối cùng được xác định.

6.2.4  Chuẩn bị dung dịch làm việc d8 (d8B và d8C) bằng pha loãng liên tiếp dung dịch gốc (d8A). Tất cả dung dịch phải được bảo quản ở nơi không có ánh sáng trong nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

Dung dịch làm việc d8

Thể tích dung dịch gốc hoặc làm việc

Thể tích nước

Nồng độ cuối cùng

Ổn định

Dung dịch làm việc d8B

20 µL dung dịch d8A

...

...

...

1,0 µg/mL

1 ngày

Dung dịch làm việc d8C

200 µL dung dịch d8B

1800 µL

100,0 ng/mL

1 ngày

CHÚ THÍCH: Người sử dụng có thể xác định thể tích chính xác được sử dụng để chuẩn bị cho đến khi nồng độ cuối cùng được xác định.

6.2.5  Chuẩn bị dung dịch chuẩn bằng pha loãng dung dịch làm việc. Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ từ 1,0 ng/mL đến 80,0 ng/mL, sử dụng ít nhất năm trong số bảy dung dịch tiêu chuẩn được đưa ra trong bảng dưới, cần bao gồm dung dịch tiêu chuẩn tương ứng với giới hạn theo yêu cầu của định lượng (hoặc thấp hơn). Chuẩn nội d8-NDELA tại mức 20 ng/mL trong mỗi dung dịch. Tất cả các dung dịch phải được bảo quản ở nơi không có ánh sáng trong khoảng 2 °C và 8 °C.

...

...

...

Thể tích dung dịch làm việc

Dung dịch làm việc d8C

Thể tích nước

Nồng độ cuối cùng

Ổn định

NDELA

D8-NDELA

Dung dịch chuẩn 1

800 µL dung dịch E

...

...

...

-

80,0 ng/mL

20,0 ng/mL

1 ngày

Dung dịch chuẩn 2

400 µL dung dịch E

200 µL

400 µL

40,0 ng/mL

...

...

...

1 ngày

Dung dịch chuẩn 3

200 µL dung dịch E

200 µL

600 µL

20,0 ng/mL

20,0 ng/mL

1 ngày

Dung dịch chuẩn 4

...

...

...

200 µL

700 ụL

10,0 ng/mL

20,0 ng/mL

1 ngày

Dung dịch chuẩn 5

500 µL dũng dịch F

200 µL

300 µL

...

...

...

20,0 ng/mL

1 ngày

Dung dịch chuẩn 6

250 µL dung dịch F

200 µL

550 µL

2,5 ng/mL

20,0 ng/mL

1 ngày

...

...

...

100 µL dung dịch F

200 µL

700 µL

1,0 ng/mL

20,0 ng/mL

1 ngày

CHÚ THÍCH 1: Phụ thuộc vào độ nhạy của thiết bị, đường chuẩn hiệu chuẩn và việc chuẩn bị mẫu có thể thay đổi hoặc điều chỉnh để giảm thiểu tác động có thể của nền (xem 6.3.3).

CHÚ THÍCH 2: Người sử dụng có thể xác định thể tích chính xác được sử dụng để chuẩn bị cho đến khi nồng độ cuối cùng được xác định.

6.3  Chuẩn bị mẫu

...

...

...

Cân chính xác khoảng 1,0 g mẫu (ghi lại khối lượng chính xác), cho 400 µL dung dịch làm việc d8B và điều chỉnh đến 20,0 mL bằng nước. Lắc trong 15 min. Nếu cần, có thể sử dụng thêm bồn siêu âm và/hoặc máy ly tâm trong 10 min một cách cẩn thận. Để tránh tạo thêm nitrosamin, cần giảm thiểu siêu âm.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng lượng mẫu nhỏ hơn và/hoặc thể tích nước ban đầu lớn hơn miễn là có độ nhạy cho phép để điều chỉnh các nền cụ thể và để giảm khả năng xảy ra các vấn đề ức chế ion hóa do các thành phần nền đồng rửa giải. Khi thay đổi thể tích nước, tạo nồng độ chuẩn nội IS phù hợp với cả trong dung dịch chuẩn và trong dung dịch mẫu. Trừ khi tính toán chính xác không thể thực hiện.

Ổn định cột C18 chiết pha rắn bằng 3,0 mL methanol tiếp theo là 3,0 mL nước có tốc độ dòng chảy xấp xỉ 3,0 mL/min. Không để cột bị khô kiệt.

Cho khoảng 5 mL dịch chiết mẫu vào cột C18 chiết pha rắn và loại bỏ khoảng 3 mL dung dịch đầu tiên. Thu khoảng 2 mL dịch chiết tiếp theo (có tốc độ dòng chảy xấp xỉ 3,0 mL/min) vào trong lọ. Nếu cần thiết, chuẩn bị mẫu lặp lại ba lần.

6.3.2  Chuẩn bị mẫu thay thế đối với các mẫu không phân tán trong nước (làm sạch bằng DCM)

Cân chính xác khoảng 0,2 g mẫu (ghi lại khối lượng chính xác) trong ống ly tâm, thêm vào 800 µL dung dịch làm việc d8C và lắc trong 1 min. Thêm 4 mL diclorometan và lắc trong 1 min. Thêm 3.2 mL nước và lắc trong 5 min.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng lượng mẫu nhỏ hơn và/hoặc thể tích nước ban đầu lớn hơn miễn là có độ nhạy cho phép đề điều chỉnh các nền cụ thể và để giảm khả năng xảy ra các vấn đề ức chế ion hóa do các thành phần nền đồng rửa giải. Khi thay đổi thể tích nước, tạo nồng độ chuẩn nội IS phù hợp với cả trong dung dịch chuẩn và trong dung dịch mẫu. Trừ khi tính toán chính xác không thể thực hiện

Ly tâm tại tốc độ cao nhất có thể (lý tưởng 20000 G) trong 5 min. Một phần của lớp nước phía trên được sử dụng cho phân tích sắc ký.

Nếu cần thiết, lọc dung dịch thu gom được qua thiết bị lọc phù hợp:

...

...

...

6.3.3  Pha loãng mẫu đâ chuẩn bị và dung dịch chuẩn (tùy chọn)

Cần pha loãng thêm các dịch chiết mẫu và dưng dịch chuẩn (tương ứng) để giảm thiểu tác động tiềm ẩn của các thành phần nền đồng rửa giải có thể ức chế ion hóa NDELA, giới hạn độ nhạy của phương pháp. Pha loãng dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn trong nước được đề xuất, theo độ nhạy trên hệ thống HPLC-MS-MS cụ thể được sử dụng.

6.3.4  Bảo quản mẫu

Nếu cần thiết, mẫu có thể được bảo quản ở nhiệt độ dưới 8 °C, không có ánh sáng.

7  Cách tiến hành

7.1  Tổng quan

Với cả hai loại chuẩn bị mẫu, dịch chiết cuối cùng được phân tích đối với NDELA bằng HPLC-MS-MS.

7.2  Các điều kiện sắc ký

Pha động:

...

...

...

Dung dịch rửa giải B - 2 mmol NH₄Ac trong 90/10 MeOH/nước (4.9)

Tỷ lệ pha động (Gradient)

Khoảng thời gian,

min

% A

% B

0 - 1,5

97

...

...

...

1,5 - 1,6

97 → 0

3 → 100

1,6 - 4,0

0

100

4,0 - 4,1

0 → 97

100 → 3

...

...

...

97

3

Lưu lượng: 0,4 mL/min

Thể tích bơm: 20 µL

Nhiệt độ lò cột: 30 °C

Bảo quản mẫu: ≤ 8 °C không có ánh sáng (được khuyến nghị)

Bơm phân tích: Mỗi lần bơm phân tích bao gồm ít nhất năm điểm hiệu chuẩn, và ít nhất một mẫu kiểm soát (dung dịch chuẩn) trên mỗi 15 dịch chiết mẫu (đối với một phân tích ít hơn 15 dịch chiết mẫu, bao gồm tối thiểu một mẫu kiểm soát). Cỡ phép phân tích cho phép sẽ bao gồm ít nhất đến 20 dịch chiết mẫu. Các cỡ phân tích lớn hơn có thể miễn là tính đủ ổn định trên khay được xác nhận.

Các điều kiện sắc ký có thể cần được điều chỉnh đối với các nền cụ thể miễn là xác nhận phù hợp (xem ISO 12787).

7.3  Các điều kiện HPLC-MS-MS

...

...

...

Ví dụ về các thông số phù hợp đối với quang phổ kế khối ba cực [như AB Sciex 5500^®3]. Cài đặt nguồn

- Điện thế phun ion (lon spray voltage ISV)

2800 V

- Thế bắn phá tụ ion (Declustering potential DP)

26 V

- Nhiệt độ nguồn (TEM)

650 °C

- Khí đầu phun (GS1)

70 đơn vị (nitơ)

...

...

...

70 đơn vị (nitơ)

- Khí chắn

30 đơn vị (nitơ)

Cài đặt máy phân tích

- Chế độ quét

Kiểm soát đa phản ứng (MRM) [hai kiểm soát phản ứng được lựa chọn (SRM) đối với NDELA và một SRM đối với IS]

- Độ phân giải Q1

đơn vị

- Độ phân giải Q3

...

...

...

- Khí phân tách kích hoạt va chạm

12 đơn vị (nitơ)

Các ion đặc tính 135 (M + H), 104 và 74 (các ion mảnh) nhận dạng sự có mặt của NDELA trong mẫu.

Định lượng NDELA được thực hiện bằng cách sử dụng tỷ lệ của cường độ của hai ion mảnh là 104 (từ NDELA) và 111 [khởi nguồn từ ion 143 (M+H) của d8-NDELA].

8  Tính toán kết quả

8.1  Xác định giá trị R

Đối với mỗi lần bơm (các điểm của đường chuẩn, mẫu thử và mẫu kiểm soát) giá trị R được xác định là tỷ lệ cường độ tín hiệu thu được giữa ion 104 từ NDELA (M+H) và ion 111 từ d8-NDELA (M+H) (xem, ví dụ, Hình A.2).

Những giá trị R này được sử dụng để xác định đường chuẩn và nồng độ, c, như được nêu tại 8.4.

8.2  Đường chuẩn

...

...

...

Đối với định lượng đường chuẩn phải có hệ số tương quan tốt hơn hoặc bằng với 0,990 (xem, ví dụ, Hình A.1).

8.3  Quy trình kiểm tra xác nhận và các tiêu chí

Cường độ liên quan của hai ion được phát hiện (104 và 74) từ dịch chiết mẫu, được biểu thị là tỷ lệ phần trăm của cường độ của ion mạnh nhất, phải tương ứng với các tỷ lệ này của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, tại nồng độ có thể so sánh được, được đo trong cùng các điều kiện, phải đạt trong phạm vi dung sai được liệt kê ở Bảng 1.

Kiểm tra xác nhận đối với mỗi phép đo dịch chiết mẫu mà mang lại nồng độ NDELA trên giới hạn phát hiện (xem tài liệu viện dẫn [1]).

…

f) Ngày thử nghiệm;

g) Các kết quả và đơn vị mà kết quả được biểu thị;

h) Phương pháp làm sạch được sử dụng;

i) Bất kỳ điểm đặc biệt nào quan sát được trong khi thử nghiệm;

...

...

...

k) Nhận dạng và chữ ký của người chịu trách nhiệm đối với báo cáo thử nghiệm.

Phụ lục A

(tham khảo)

Ví dụ về đường chuẩn và sắc ký đồ

CHÚ DẪN:

X nồng độ của NDELA trong dung dịch chuẩn (ng/mL)

Y giá trị R

Hình A.1 - Ví dụ về đường chuẩn đối với NDELA

...

...

...

Hình A.2 - Ví dụ về sắc ký đồ HPLC-MS-MS

Từ phân tích 1,0 ng/mL dung dịch tiêu chuẩn hiệu chuẩn, tương ứng 20 ng/g NDELA tương đương trong nền. Dữ liệu nhận được sử dụng bộ ba AB Sciex 5500, với độ pha loãng gấp 4 lần dịch chiết mẫu trong nước, trước khi phân tích. Trên cùng bên trái: NDELA (lượng hóa SRM); trên cùng bên phải: NDELA (SRM thứ hai); đáy: d8-NDELA (SRM chuẩn nội).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] 2002/657/EC: Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results [notified under document number C (2002) 3044] [Quyết định của Ủy ban ngày 12/8/2002 thực hiện Chỉ thị Hội đồng 96/23/EC liên quan đến thực hiện các phương pháp phân tích và diễn giải các kết quả [được thông báo theo số tài liệu C (2002) 3044]

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12971:2020 (ISO 15819:2014) về Mỹ phẩm - Phương pháp phân tích - Các nitrosamin: Phát hiện và xác định N-nitrosodietanolamin (NDELA) bằng HPLC-MS-MS