Hình A.1 - Báo cáo thử mẫu

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp lấy mẫu theo định lượng

B.1  Lấy mẫu bằng dụng cụ lấy mẫu có khe (xem Hình 1)

B.1.1  Nguyên lý

Nguyên lý lấy được các vi sinh vật bằng dụng cụ lấy mẫu có khe (dụng cụ thử không khí có va chạm) là nguyên lý đơn giản và có độ tin cậy. Không khí từ một thiết bị không khí nén được dẫn theo kênh qua một đường nối được thiết kế chuyên dùng và được tăng tốc qua một khe hẹp về phía bề mặt aga ẩm các vi sinh vật, do khối lượng của chúng, đã lao vào bề mặt aga, trong khi các phân tử không khí đã đi lệch hướng. Được ủ để phát triển vi sinh vật một cách thích hợp, các vi sinh vật được tăng lên thành các cụm khuẩn lạc và chúng được đến dựa trên giả thiết rằng một vi sinh vật tăng lên thành một cụm khuẩn lạc.

Có thể sử dụng dụng cụ lấy mẫu có khe cho vi khuẩn, nấm men hoặc nấm và với các phương pháp chuyên dùng, có thể sử dụng dụng cụ lấy mẫu này cho các vi rút và các thể thực khuẩn. Vì một bề mặt aga lớn (ví dụ đĩa Petri 140 mm) quay dưới một khe được bố trí hướng tâm (0,5 mm) cho nên có thể đếm được một số lượng lớn các cụm khuẩn lạc, nghĩa là các vi sinh vật.

...

...

...

Sự chấp nhận các kỹ thuật vô khuẩn bao hàm cả phương pháp học lấy mẫu. Nên sử dụng chất khử khuẩn như ethanol 70%. Trong các khoảng thời gian khi không sử dụng (được bảo quản) dụng cụ lấy mẫu có khe, phải có sự đề phòng để tránh sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong thiết bị. Nên thực hiện tất cả các thao tác trong đó thiết bị thử được mở ra trong thời gian ngắn nhất để tránh sự thâm nhập có thể có của các chất nhiễm bẩn từ môi trường lân cận xung quanh. Cũng nên có sự đề phòng tránh các ảnh hưởng của gió lùa.

B.2  Quy trình lấy mẫu

Phải sử dụng quy trình lấy mẫu sau:

a. Tiệt khuẩn toàn bộ thiết bị lấy mẫu bằng cách khử khuẩn đối với thiết bị, bao gồm cả các ống và ống mềm với chất làm sạch thích hợp ngay trước khi sử dụng.

b. Cho một mẫu thử đi qua thiết bị lấy mẫu và các ống, ống mềm gắn liền mà không có đĩa petri và aga. Thực hiện yêu cầu này cho phép làm bay hơi chất khử khuẩn và điều chỉnh dụng cụ lấy mẫu có khe.

c. Thực hiện phép thử có mành chắn trước và sau phép đo thực bằng thực hiện các bước d tới f mà không khởi động dụng cụ lấy mẫu có khe. Các đĩa được sử dụng sau đó không được biểu lộ ra sự sinh trưởng.

d. Lấy một đĩa Petri 14 cm có aga. Đĩa Petri phải có nhãn được gắn cố định vào đáy có thông tin truy tìm nguồn gốc (ngày, thời gian khởi động, địa chỉ, địa điểm thử, mã v.v...) chỉ thị vị trí khởi động và chiều quay.

e. Bảo đảm rằng dụng cụ chỉ thị không khí vào và mức của dụng cụ lấy mẫu khe tăng lên. Nâng nắp của dụng cụ lấy mẫu có khe lên và bảo đảm rằng giá đỡ đĩa được đặt đúng vị trí so với công tắc chuyển mạch nhỏ.

Lau các mặt bên trong của dụng cụ lấy mẫu có khe bằng một đệm khử khuẩn.

...

...

...

g. Đặt lại nắp của dụng cụ lấy mẫu có khe một cách nhanh chóng ngay sau khi tháo nắp của đĩa Petri.

h. Tháo lỏng dụng cụ chỉ thị mức và hạ dụng cụ này một cách cẩn thận xuống bề mặt của aga. Hạ thấp cửa không khí vào sao cho kim của dụng cụ chỉ thị chỉ trực tiếp vào cạnh bên dưới của đường rãnh. Nâng lại dụng cụ chi mức lên vị trí trên của nó và kẹp chặt dụng cụ này lại.

i. Bắt đầu sấy mẫu tự động bằng cách ấn nút khởi động. Ghi lại thời gian khởi động, thời gian lấy mẫu, các giả thiết cho thử nghiệm và các điều kiện hoặc các quan trắc khác có thể ảnh hưởng đến các phép đo.

j. Khi đèn hiệu tắt, quá trình lấy mẫu kết thúc. Với nút ấn khởi động/ dừng ở vị trí tắt, nâng cửa dẫn không khí vào lên.

k. Tháo lỏng nắp của dụng cụ lấy mẫu có khe và nâng nắp lên một cách cẩn thận, đồng thời lấy nắp của đĩa Petri tử trong túi chất dẻo vô khuẩn ra và lắp đặt lại nắp này trên đĩa Petri. Phải quan sát cẩn thận và rất chú ý trong quá trình này để không gây nhiễu loạn cho aga và mẫu thử.

l. Tháo đĩa Petri ra khỏi thiết bị, lấy mẫu và lắp đặt lại nắp của dụng cụ lấy mẫu có khe. Dán kín đĩa Petri bằng băng và đặt lại đĩa Petri vào trong túi vô khuẩn và dán kín túi lại bằng băng.

m. Các đĩa Petri được ủ để phát triển vi sinh vật ở nhiệt độ thuận tiện và đọc nhiệt độ này sau một thời gian thích hợp. Xem B.3. Ở vùng tâm và mép ngoài bề mặt của aga không được có các cụm khuẩn lạc.

CHÚ THÍCH: Đường bắt đầu/ kết thúc có thể chứa “thêm” các cụm khuẩn lạc.

n. Di chuyển cần khởi động của giá đỡ đĩa qua công tắc chuyển mạch nhỏ tới một vị trí khởi động mới.

...

...

...

p. Bắt đầu lại quy trình này từ lúc đầu khi thực hiện một quá trình lấy mẫu mới.

Khi sử dụng cùng một phương tiện vận chuyển, truy tìm nguồn gốc “về mặt địa lý" của đĩa Petri trên toàn bộ quãng đường từ nhà sản xuất, người đã đổ đầy aga lên các đĩa Petri, tới địa điểm lấy mẫu và phòng thí nghiệm để bảo đảm đĩa có thể được kiểm tra để không đưa vào sử dụng sau khi đã nhiễm bẩn. Đĩa không được biểu lộ sau đó sự sinh trưởng của vi sinh vật.

B.3  Ủ để phát triển chất nhiễm bẩn vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển được

Nói chung nhiệt độ thích hợp trong quá trình ủ để phát triển vi sinh vật là nhiệt độ gần với môi trường sống trong đó vi sinh vật đã hiện diện trước khi lấy mẫu. Nên ủ các vi khuẩn hoặc nấm ưa nhiệt độ trung bình ở các nhiệt độ 20 °C đến 30 °C. Đối với các vi khuẩn chịu nhiệt riêng có thể yêu cầu các nhiệt độ khác. Khoảng thời gian ủ để phát triển vi sinh vật tới mười bốn ngày là bình thường đối với nấm, trong khi đối với vi khuẩn ưa nhiệt độ trung bình thì khoảng thời gian ủ thường thay đổi từ hai đến mười bốn ngày. Có thể xem xét đến các nhiệt độ ủ khác.

Có thể sử dụng các môi trường có chọn lọc (các aga) để cách ly, ví dụ, các vi khuẩn gram âm phải có sự kiểm tra trong phạm vi một khoảng thời gian đã cho (ví dụ: 24 h).

B.4  Đo các đơn vị cấu thành khuẩn lạc (CFU)

Có thể kiểm tra các môi trường không có chọn lọc và đếm sự sinh trưởng sớm hơn 24 h sau khi bắt đầu ủ để phát triển vi sinh vật và sau đó cứ 24 h đếm lại một lần trong khoảng thời gian mười đến mười bốn ngày. Phải có sự quan sát thường xuyên trong khoảng thời gian ủ để đếm và ghi lại các cụm khuẩn lạc khi chúng nhô lên để tránh việc đếm không chính xác do sự sinh trưởng quá mức của các cụm khuẩn lạc.

Phụ lục C

...

...

...

Lấy mẫu nội độc tố

C.1  Quy định chung

Lấy mẫu các nội độc tố (các độc tố sinh ra trong vi sinh vật) trong không khí nén là một quá trình khó khăn đòi hỏi phải sử dụng các ống chất dẻo mới (virgin) và các bình thủy tinh mới cũng như các nhân viên có kinh nghiệm trong các lĩnh vực kỹ thuật yêu cầu. Tuy nhiên, có thể xác định sự hiện diện của các nội độc tố trong không khí nén bằng cách đo số lượng các vi khuẩn gram - âm trong phần ngưng tụ của không khí nén.

Tuy vậy, nên thực hiện phép đo bổ sung hàm lượng của các vi khuẩn, nấm hoặc nấm men trong phần ngưng tụ.

C.2  Quy trình lấy mẫu

Cảnh báo - Chỉ một lượng rất ít nanogram nội độc tố (vật phế thải từ vi khuẩn gram-âm) trong không khí nén có thể gây ra bệnh.

Phải sử dụng quy trình sau để đo vi khuẩn gram-âm trong phần ngưng tụ của không khí nén. Phải thực hiện quy trình kỹ thuật làm việc vô khuẩn tại mọi thời điểm. Phải sử dụng một que nhúng thích hợp với môi trường aga. Đĩa thử phải là điểm thuận tiện trong hệ thống không khí nén được khảo sát, tại đó có thể thu gom phần ngưng tụ.

a. Khử trùng điểm thử với ethanol 70% ngay trước khi lấy mẫu.

b. Tháo nắp bình có gắn bản kính được phủ môi trường aga.

...

...

...

d. Nhũng nắp có bản kính gắn liền vào mẫu thử trong thời gian khoảng 10s. Điều quan trọng là cả hai bề mặt của aga tiếp xúc mật thiết với mẫu thử.

e. Lấy bản kính ra một cách từ từ khỏi mẫu thử trong thời gian khoảng 3s.

f. Tháo cạn bình.

g. Sau khi cấy vi khuẩn, lắp đặt lại bản kính vào trong bình. Ở giai đoạn này, bình cùng với bản kính có thể được bảo quản hoặc vận chuyển hàng giờ mà không ảnh hưởng đến kết quả. Không bao giờ cho phép bình chứa bản kính mầu đóng băng.

h. Ủ để phát triển vi sinh vật các bản kính ở +27 °C đến 14 ngày. Nếu các sinh vật sinh trưởng rất chậm thì thời gian ủ có thể kéo dài đến một tháng.

i. Sau khi ủ để phát triển vi sinh vật, lấy bản kính ra khỏi bình một cách rất cẩn thận. Kiểm tra sự sinh trưởng và các phản ứng màu theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Mức chấp nhận đối với vi khuẩn, nấm men và nấm là 10.000 CFU/ml phần ngưng tụ. Nếu tìm thấy một vi khuẩn giảm âm trong phần ngưng tụ thì nội độc tố hiện diện trong không khí nén, và chi tiết ẩm ướt của thiết bị phải được làm sạch và khử khuẩn.

Phụ lục D

...

...

...

Chuẩn bị đĩa Petri có môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Quy trình sau có hiệu lực đối với cả hai môi trường nuôi cấy vi sinh vật, aga đếm vi khuẩn trong hộp cấy Petri và Saboroud có dex troza 4%.

a. Cân định lượng môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo quy định của nhà sản xuất và hòa tan môi trường này trong nước.

b. Hấp môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min.

c. Sau khi làm nguội đến khoảng +50 °C, đo độ pH và nếu cần thiết, điều chỉnh độ pH tới độ pH công bố bằng hydrochloric a xít hoặc Natri hydroxide.

d. Sử dụng các đĩa Petri bằng chất dẻo vô khuẩn 14cm, đổ 65ml môi trường nuôi cấy vi sinh vật vào mỗi đĩa.

e. Khi môi trường nuôi cấy vi sinh vật đã nguội và đông cứng, bao gói mỗi đĩa Petri vào hạt túi chất dẻo vô khuẩn.

1. Khép kín túi thứ nhất bằng gấp mép đơn giản hai lầm qua dấu niêm phong.

2. Dán kín túi thứ hai một cách chắc chắn bằng hàn mép túi lại.

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 °C)

[2] TCVN 4993 (ISO 7954), Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung đếm nấm men và nấm mốc - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 25 °C.

[3] TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11256-7:2015 (ISO 8573-7:2003) về Không khí nén - Phần 7: Phương pháp xác định hàm lượng chất nhiễm bẩn vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển được