TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 6263 : 1997

SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA – CHUẨN BỊ MẪU THỬ VÀ CÁC DUNG DỊCH PHA LOÃNG ĐỂ KIỂM TRA VI SINH
Milk and milk products – Preparation of test samples and dilutions for microbiological examination

Lời nói đầu

TCVN 6263 : 1997 hoàn toàn tương đương với ISO 8261 : 1989 (E)

TCVN 6263 : 1997 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ va Môi trường ban hành.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định chung cho việc chuẩn bị:

...

...

...

- các dung dịch pha loãng ban đầu và;

- các dung dịch pha loãng tiếp theo để kiểm tra vi sinh trong sữa và sản phẩm sữa.

2. Tiêu chuẩn trích dẫn

ISO 707 Sữa và các sản phẩm sữa – Các phương pháp lấy mẫu

3. Định nghĩa

Áp dụng các định nghĩa sau đây cho tiêu chuẩn này:

3.1. Dung dịch pha loãng ban đầu (huyền phù ban đầu): là huyền phù, dung dịch hoặc nhũ tương thu được sau khi cân hoặc đong sản phẩm cần kiểm tra (hoặc mẫu được lấy từ sản phẩm) đã được trộn, với một lượng chất lỏng lớn gấp chín lần để pha loãng (chất pha loãng, xem điều 5), nếu cần thì dùng máy trộn và phải tuân thủ các quy định thích hợp (xem điều 8), nếu có các hạt to thì để chúng lắng xuống.

Chú thích – Trong một số trường hợp, đặc biệt đối với các sản phẩm cho huyền phù ban đầu 1 + 9 rất quánh hoặc quá đặc, phải cho thêm dịch pha loãng. Trong một số trường hợp khác, đối với các kết quả thử liên quan đến các chuẩn mực yêu cầu, có thể cần dung dịch pha loãng ban đầu 1 + 9 đậm đặc hơn. Các yếu tố này cần phải đạt được tính đến trong những thao tác tiếp theo và/hoặc trong biểu thị kết quả.

3.2. Các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo: Các chất huyền phù, các dung dịch hoặc các thể nhũ tương thu được bằng cách trộn một thể tích chính xác của dung dịch pha loãng ban đầu (3.1), với thể tích chất pha loãng lớn gấp chín lần (xem chú thích trong 3.1) và bằng cách lặp lại các thao tác này với mỗi lần pha loãng như vậy cho đến khi thu được các dãy dung dịch pha loãng thập phân thích hợp cho việc nuôi cấy trong môi trường nuôi cấp.

...

...

...

Chuẩn bị dung dịch pha loãng ban đầu (huyền phù ban đầu) (3.1) và, nếu cần, chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo (3.2) để giảm bớt số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích để thuận tiện cho việc kiểm tra vi sinh.

5. Chất pha loãng

5.1. Nguyên liệu chính

Để làm tăng độ tái lập của kết quả, nên sử dụng các thành phần chính khô, hoặc các môi trường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị các chất pha loãng và các môi trường nuôi cấy. Cần tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn của nhà sản xuất.

Các hóa phẩm sử dụng phải đạt chất lượng phân tích.

Nước sử dụng phải là nước được cất bằng dụng cụ thủy tinh, hoặc nước đã khử ion. Nước này không được chứa các chất có thể ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong các điều kiện thử đã nêu. Điều này phải được kiểm tra định kỳ, đặc biệt khi sử dụng nước khử ion.

Chú thích: Các thử nghiệm kiểm tra tính phù hợp của nước dùng trong kiểm tra vi sinh đã được công bố trong Marth, E.H., Các phương pháp chuẩn để kiểm tra các sản phẩm sữa, xuất bản lần thứ 15, 1984 Washhington, D.C., USA: Hiệp hội Y tế Mỹ.

Sử dụng các dung dịch natri hidroxit và axit clohidric (khoảng 0,1 mol/l) để điều chỉnh pH của chất pha loãng và môi trường.

5.2. Chất pha loãng dùng cho các mục đích chung

...

...

...

Thành phần

Pepton                          1,0g

Natri clorua (NaCl)          8,5g

Nước                            1000 ml

Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần

Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ± 0,1, ở 25⁰C.

5.2.2. Dung dịch Ringer nồng độ một phần tư

Thành phần

Natri clorua (NaCl)                                  2,25g

...

...

...

Canxi clorua (CaCl₂)                               0,06g

Natri hidrocacbonat (NaHCO₃)                 0,05g

Nước                                                    1000 ml

Chuẩn bị

Hòa tan các muối trong nước

Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 6,9 ± 0,1, ở 25⁰C.

5.2.3. Dung dịch pepton

Thành phần

Pepton                          1,0g

...

...

...

Chuẩn bị

Hòa tan pepton trong nước

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ± 0,1, ở 25⁰C.

5.2.4. Dung dịch đệm photphát

Thành phần của dung dịch gốc

Kali dihidrophotphát (KH₂PO₄)                 42,5g

Nước                                                    1000 ml

Chuẩn bị

Hòa tan muối trong 500ml nước

...

...

...

Pha loãng bằng nước tới 1000 ml. Bảo quản dung dịch gốc này trong kiện lạnh.

Trước khi sử dụng, thêm 1 ml dung dịch gốc này (ở 20⁰C) vào 1000 ml nước dùng như chất pha loãng.

5.3. Chất pha loãng dùng cho các mục đích riêng biệt.

5.3.1. Dung dịch natri xitrat (dùng đối với trường hợp phomát, phomát chế biến và sữa sấy màng)

Thành phần

Trinatri xitrat ngậm 2 phân tử nước (Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)       20,0g

Nước                                                                            1000 ml

Chuẩn bị

Hòa tan muối trong nước bằng cách đun nóng ở khoảng từ 45⁰C đến 50⁰C.

...

...

...

5.3.2. Dung dịch dikali hidrophotphat (dùng đối với trường hợp phomát, phomát chế biến, casein, casein axit, casein lactic khô, caseinat, bột của dịch sữa axit và kem sữa chua).

Thành phần

Dikali hidro photphat  (K₂HPO₄)                                       20g

Nước                                                                            1000 ml

Chuẩn bị

Hòa tan muối trong nước bằng cách đun nóng ở khoảng từ 45⁰C đến 50⁰C.

Điều chỉnh pH. Đối với độ pha loãng ban đầu của casein axit và casein lactic và bột của dịch sữa axit, pH sau khi khử trùng, phải là 8,4 ± 0,1, ở 25⁰C. Còn đối với caseinat, phomát, phomát chế biến, váng sữa chua, pH sau khi khử trùng, phải là 7,5 ± 0,1, ở 25⁰C.

5.4. Phân phối, khử trùng và bảo quản chất pha loãng

Phân phối chất pha loãng (5.2 hoặc 5.3) dùng cho độ pha loãng ban đầu vào các bình hoặc các lọ (6.4). Phân phối chất pha loãng dùng cho các bộ pha loãng thập phân tiếp theo (5.2) vào các ống nghiệm hoặc các lọ nhỏ (6.5). Lượng được phân phối sau khi khử trùng chứa trong mỗi bình hoặc lọ (6.4) phải chứa 90 ml chất pha loãng hoặc một bội số của 90 ml, và mỗi ống nghiệm hoặc lọ nhỏ (6.5) phải chứa 9,0 ml chất pha loãng hoặc một bội số của 9,0 ml (hoặc các lượng khác theo yêu cầu).

...

...

...

Khử trùng bằng hấp áp lực ở 121⁰C ± 1⁰C trong 15 phút (đối với các thể tích lớn hơn có thể phải hấp lâu hơn).

Nếu chất pha loãng không sử dụng ngay, bảo quản ở chỗ tối từ 0⁰C đến 5⁰C, nhưng không quá 1 tháng dưới các điều kiện không làm thay đổi thể tích hoặc thành phần của chúng.

Chú thích – Nếu cần thiết phải đếm một vài nhóm vi sinh vật, sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau, cũng có thể cần thiết phải phân phối tất cả các chất pha loãng (hoặc một số) với các lượng nhiều hơn 9,0 ml; do đó kích thước các ống nghiệm, bình và lọ (6.4 và 6.5) cũng phải quy định tương ứng.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Chú thích – Có thể dùng các dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần để thay thế cho các dụng cụ sử dụng nhiều lần, nếu nó phù hợp với các yêu cầu quy định. Dụng cụ thủy tinh tái sử dụng cần phải có độ bền tốt khi khử trùng lặp lại và phải trơ về mặt hóa học.

Sử dụng các thiết bị thí nghiệm vi sinh thông thường và các dụng cụ đặc biệt là:

6.1. Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) (nồi hấp có thể dùng riêng rẽ hoặc dùng như một phần của thiết bị để chuẩn bị và phân phối môi trường).

Mọi thiết bị tiếp xúc với chất pha loãng, mẫu thử, hoặc dung dịch pha loãng, không kể các thiết bị đã khử trùng sẵn (các túi bằng chất dẻo), đều phải được khử trùng bằng một trong các phương pháp sau:

a) giữ trong tủ sấy ở 170⁰C đến 175⁰C không ít hơn 1 giờ;

...

...

...

Pipet không phải khử trùng bằng hấp áp lực, bởi vì hơi nước sẽ đọng lại phía trong khi nguội và ảnh hưởng đến độ chính xác của phép thử.

6.2. Thiết bị nghiền – trộn

Có thể sử dụng một trong các thiết bị sau đây:

a) Máy trộn quay, vận hành với tốc độ từ 8 000 đến 45 000 vòng trên phút, có cốc đựng bằng thủy tinh hoặc bằng kim loại gắn với nắp, chịu được các điều kiện khử trùng;

b) máy trộn kiểu nhu động, có các túi bằng chất dẻo vô trùng;

Chú thích – Cốc hoặc túi bằng chất dẻo phải có đủ dung tích để trộn mẫu với lượng chất pha loãng thích hợp. Nói chung, thể tích của hộp đựng phải gấp đôi thể tích của mẫu thử cộng với chất pha loãng.

6.3. Máy trộn, có khả năng trộn 1 ml hoặc 2 ml mẫu thử (trong trường hợp mẫu dạng lỏng), hoặc các dung dịch pha loãng thập phân, với 9 ml hoặc 18 ml chất pha loãng trong một ống nghiệm có kích thước thích hợp, để thu được chất huyền phù đồng nhất, và máy hoạt động theo nguyên lý quay lệch tâm chất chứa trong ống nghiệm (máy trộn Vortex).

6.4. Bình hoặc lọ, có đủ dung tích để chứa 90 ml chất pha loãng dùng để tạo huyền phù ban đầu, hoặc bội số của 90 ml, và còn có khoảng trống để trộn.

6.5. Ống nghiệm (bình hoặc lọ nhỏ), có đủ dung tích để chứa 10 ml mẫu thử (hoặc bội số của 10 ml) (khi mẫu thử dạng lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ban đầu (trong các trường hợp khác) hoặc các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, và còn có khoảng trống phía trên để trộn.

...

...

...

Chú thích – Chỉ sử dụng các pipet có đầu còn nguyên vẹn, nên dùng loại có vạch chia rõ dễ phân biệt dung tích.

6.7. Pipet chia độ (được nhét nút bông ở đầu), có dung tích tương đối lớn, thí dụ: 10 ml hoặc 20 ml.

Chú thích – Chỉ sử dụng các pipet có đầu còn nguyên vẹn, nên dùng loại có vạch chia rõ dễ phân biệt dung tích.

6.8. Bi thủy tinh có đường kính khoảng 6 mm.

6.9. pH mét, có độ chính xác tới ± 0,1 đơn vị.

6.10. Cân, có khoảng cân phù hợp và có độ chính xác nằm trong giới hạn 1% khối lượng được cân.

6.11. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 45⁰C ± 1⁰C

6.12. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 37⁰C ± 1⁰C

7. Lấy mẫu

...

...

...

8. Cách tiến hành

Chú thích

1) Đối với một vài trường hợp nghiên cứu đặc biệt (thí dụ như Salmonela) phải cần đến kỹ thuật đặc biệt hoặc phòng ngừa đặc biệt. Trong những trường hợp như vậy kỹ thuật đặc biệt là vấn đề được đề cập tới trong tiêu chuẩn.

2) Các thao tác mô tả trong các điều 8.1 và 8.2 không được tiến hành trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời.

3) Luôn luôn phải chú ý đảm bảo vô trùng.

8.1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha loãng ban đầu

Để tránh làm ảnh hưởng các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ của chất pha loãng trong suốt quá trình thao tác mô tả dưới đây luôn phải giữ bằng nhiệt độ của mẫu thử; trừ khi có quy định khác.

8.1.1. Sữa và các sản phẩm sữa dạng lỏng.

Trộn mẫu thử thật kỹ sao cho các vi sinh vật phân bố càng đều càng tốt bằng cách đảo chiều lọ chứa liên tục 25 lần. Cần phải tránh tạo bọt hoặc để bọt tan hết. Khoảng thời gian từ khi trộn đến khi lấy phần mẫu để thử không được vượt quá 3 phút.

...

...

...

Lắc đều dung dịch pha loãng ban đầu này (thí dụ, lắc 25 lần với khoảng di động là 300 mm, trong 7 giây). Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10^-1.

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2,

8.1.2. Sữa bột, bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát có đường, bột bơ loãng và lactoza.

Trộn kỹ lượng chứa trong lọ kín bằng cách lắc và đảo chiều liên tục. Nếu mẫu thử đựng trong lọ kín còn nguyên, quá đầy nên khó lắc trộn thì chuyển sang lọ chứa to hơn. Trộn đều. Mở nắp, dùng thìa xúc, lấy phần mẫu thử theo yêu cầu và tiến hành theo chỉ dẫn dưới đây. Đóng nắp lọ lại ngay.

Hâm nóng lọ chứa 90 ml chất pha loãng thích hợp (5.2 hoặc, nếu cần đối với sữa sấy màng, dùng chất pha loãng 5.3.1, ở pH 7,5 ± 0,1) tới 45⁰C ± 1⁰C trong nồi cách thủy (6.11).

Cân 10 g mẫu thử cho vào bình thủy tinh thích hợp (thí dụ như cốc có mỏ) và rót dần bột vào lọ pha loãng có chứa chất pha loãng đã chọn. Cách khác, cân 10 g mẫu thử cho trực tiếp vào lọ đựng chất pha loãng.

Để hòa tan, xoay tròn từ từ lọ này cho ướt bột và sau đó lắc lọ 25 lần, với khoảng di động là 300 mm, trong khoảng 7 giây. Có thể dùng máy trộn kiểu nhu động (6.2.b) để thay cho việc lắc.

Đặt lọ mẫu vào nồi cách thủy trong 5 phút và thỉnh thoảng lắc.

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2.

...

...

...

8.1.3. Phomát và phomát chế biến

Hoặc cân 10g mẫu thử trong một đĩa và chuyển vào cốc đựng của máy trộn quay (6.2.a), hoặc túi đựng của máy trộn kiểu nhu động (6.2.b), hoặc cân 10 g mẫu thử cho trực tiếp vào cốc chứa.

Khi dùng máy trộn quay, hoặc máy trộn kiểu nhu động, cho thêm 90 ml chất pha loãng (5.2, 5.3.1, hoặc 5.3.2, pH 7,5 ± 0,1). Trộn cho đến khi phomát tan đều (từ 1 phút đến 3 phút). Trong trường hợp dùng máy trộn quay, vận hành máy trong một thời gian đủ để tạo được 15 000 đến 20 000 vòng quay. Với máy trộn quay chậm nhất thì thời gian cũng không được vượt quá 2,5 phút. Tốt nhất là phải đảm bảo nhiệt độ của quá trình tan không vượt quá 40⁰C, và trong mọi trường hợp không để nhiệt độ vượt quá 45⁰C. Để cho bọt tan hết.

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2.

8.1.4. Axit casein, casein lactic và bột của dịch sữa axit

Cân 10 g sản phẩm trong một đĩa. Chuyển vào lọ pha loãng có chứa bi thủy tinh và 90 ml chất pha loãng dikali hidrophotphat (5.3.2), ở pH 8,4 ± 0,1 đối với trường hợp casein axit, casein lactic.

Để yên 15 phút và sau đó tăng nhiệt độ lên 37⁰C ± 1⁰C trong nồi cách thủy (6.12).

Giữ lọ ở 37⁰C thêm 15 phút nữa và lắc mạnh từng đợt.

Chú thích – không nên sử dụng máy trộn quay (6.2.a) hoặc máy trộn kiểu nhu động (6.2.b) vì sẽ tạo nhiều bọt.

...

...

...

8.1.5. Caseinat

Hoặc là cân 10 g sản phẩm vào một đĩa và chuyển vào cốc đựng của máy trộn quay (6.2.a), hoặc túi đựng của máy trộn kiểu nhu động (6.2.b), hoặc cân 10 g mẫu thử cho trực tiếp vào bình chứa. Thêm 90 ml chất pha loãng dikali hirdophotphat (5.3.2), pH 7,5 ± 0,1 ở nhiệt độ môi trường. Trộn trong 2 phút. Trong trường hợp dùng máy trộn quay, vận hành máy trong một thời gian đủ để tạo được 15 000 đến 20 000 vòng quay. Với máy trộn quay chậm nhất thì thời gian cũng không được vượt quá 2,5 phút.

Tăng nhiệt độ lên 37⁰C ± 1⁰C trong nồi cách thủy (6.12). Trong trường hợp dùng máy trộn quay, cho vào bình. Giữ lọ ở 37⁰C thêm 15 phút nữa. Để cho bọt tan hết trước khi tiếp tục tiến hành.

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2.

8.1.6. Bơ

Cân 10 g mẫu thử cho vào bình chứa và đặt trong nồi cách thủy (6.11) ở 45⁰ ± 1⁰C. Giữ trong nồi cách thủy cho đến khi tất cả mẫu thử vừa tan chảy hết. Thêm 90 ml chất pha loãng (5.2). Trộn. Thao tác này rất dễ dàng khi thực hiện bằng máy trộn kiểu nhu động (6.2.b).

Cách khác, chỉ sử dụng pha nước để pha loãng như sau:

Lấy 50 g phần mẫu thử (có chứa khoảng 8 ml nước) và thêm 42 ml chất pha loãng (5.2.3) đã được hâm nóng đến 45⁰C. Đặt hộp đựng vào nồi cách thủy (6.11) ở 45⁰C ± 1⁰C cho đến khi bơ tan hết. Lắc kỹ và để cho tách pha không quá 15 phút.

Để tách pha, nếu thấy cần, chuyển phần đã tan chảy sang ống li tâm vô trùng (hoặc làm tan trực tiếp phần mẫu thử trong ống này) và li tâm với tần số quay từ 1 000 đến 2 000 vòng trên phút.

...

...

...

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2.

8.1.7. Sản phẩm sữa đông lạnh (bao gồm cả kem lạnh thực phẩm)

Tiến hành như trường hợp đối với bơ (8.1.6) (cách thứ nhất) nhưng dùng nồi cách thủy (6.12), ở nhiệt độ không vượt quá 37⁰C ± 1⁰C (6.12). Nhiệt độ của mẫu thử không được vượt quá nhiệt độ của nồi cách thủy này.

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2.

8.1.8 Custard, món tráng miệng, sữa lên men và váng kem

Cân 10 g mẫu thử cho vào một bình (6.4) có chứa bi thủy tinh (6.8)

Đối với custard, món tráng miệng và váng kem ngọt, thêm 90 ml chất pha loãng (5.2) và lắc cho tan đều. Đối với sữa lên men và váng kem chua, sử dụng chất pha loãng 5.3.2, ở pH 7,5 ± 0,1. Có thể sử dụng máy trộn kiểu nhu động (6.2.b).

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2.

8.2. Dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo

...

...

...

Dùng pipet sạch lấy 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu (thí dụ 8.1.1 hoặc 8.1.2) cho vào một ống nghiệm khác chứa 9 ml chất pha loãng vô trùng (5.2), không để pipet tiếp xúc với chất pha loãng (xem các chú thích trong 3.1 và 5.4). Mỗi lần pha loãng phải sử dụng một pipet mới.

Nếu yêu cầu các thể tích lớn hơn, lấy 10 ml dung dịch pha loãng ban đầu cho vào một lọ chứa 90 ml chất pha loãng vô trùng (5.2), hoặc lấy 11 ml dung dịch pha loãng ban đầu cho 99 ml chất pha loãng vô trùng (5.2).

Chú thích 2 – Trong cách tiến hành bình thường, nếu cần dung dịch pha loãng 10^-3, lấy 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu cho vào 99 ml chất pha loãng vô trùng (5.2).

Trộn kỹ, hoặc bằng cách dùng pipet sạch hút thả 10 lần, hoặc dùng máy trộn cơ học (6.3) trong 5 giây đến 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10^-2. Tần số quay phải chọn sao cho chất lỏng khi xoáy dâng cao từ 2 cm đến 3cm kể từ mép bình chứa.

Nếu cần, lặp lại các thao tác này bằng pipet vô trùng sử dụng dung dịch pha loãng 10^-2 và các dung dịch pha loãng khác để nhận được các dung dịch pha loãng 10^-3, 10^‑4 v.v… cho đến khi thu được số lượng vi sinh vật thích hợp chứa trong 1 mililít (xem điều 4).

Khi lấy tỷ lệ 10 ml cộng 90 ml, 11 ml cộng 99 ml thì lắc bằng tay theo quy định trong 8.1.1.

8.3. Thời gian tiến hành

Thời gian từ lúc kết thúc việc chuẩn bị dung dịch pha loãng ban đầu và trộn các dung dịch với môi trường (quy định trong các phương pháp kiểm tra đặc biệt) không được quá 15 phút.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6263:1997 (ISO 8261 : 1989 (E)) về sữa và các sản phẩm sữa – chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành