5. Phương pháp thử

5.1. Xác định độ hòa tan, theo 3.7 trong TCVN 6469:2010.

5.2. Nhận biết các chất màu, theo 3.2 trong TCVN 6470:2010.

5.3. Xác định hao hụt khối lượng khi sấy, theo 3.15 trong TCVN 6470:2010.

5.4. Xác định hàm lượng các chất không tan trong nước, theo 3.5 trong TCVN 6470:2010.

5.5. Xác định hàm lượng chất màu tổng số, theo 3.3.2 (Phương pháp chuẩn độ với titan triclorua) trong TCVN 6470:2010.

Lượng mẫu: từ 1,0 g đến 1,1 g;

Chất đệm: 15 g natri hydro tartrat.

1,00 ml dung dịch titan triclorua (TiCI₃) 0,1 N tương đương 23,32 mg chất màu.

...

...

...

5.6.1. Nguyên tắc

Tách các đồng phân và các chất màu phụ bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng phương pháp ngoại chuẩn.

5.6.2. Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, nước sử dụng phải là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

5.6.2.1. Axetonitril, dùng cho HPLC.

5.6.2.2. Amoni axetat, dùng cho HPLC.

5.6.2.3. Chất chuẩn dinatri 3,3'-dioxo-[delta^2,2'-biindolin]-5,5'-disulfonat.

5.6.2.4. Chất chuẩn dinatri 3,3'-dioxo-[delta^2,2'-biindolin]-5,7'-disulfonat.

5.6.2.5. Dung dịch chuẩn gốc, 1 000 mg/ml

...

...

...

5.6.2.6. Dung dịch chuẩn làm việc

Từ các dung dịch chuẩn gốc (5.6.2.5), chuẩn bị năm dung dịch chuẩn làm việc có dải nồng độ từ 1 mg/ml đến 20 mg/ml.

5.6.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.6.3.1. Bình định mức, dung tích 50 ml và 100 ml.

5.6.3.2. Hệ thống HPLC, được trang bị detector tử ngoại-khả kiến (UV/VIS) hoặc detector mảng diod và bộ bơm mẫu.

5.6.4. Cách tiến hành

5.6.4.1. Chuẩn bị mẫu thử

Cân 0,10 g mẫu thử (w₂), chính xác đến 0,1 mg, chuyển vào bình định mức 100 ml (V) (5.6.3.1) và thêm nước đến vạch (dung dịch mẫu thử S_A).

...

...

...

5.6.4.2. Điều kiện HPLC

- bước sóng detector:

610 nm;

- cột:

C18 trên silica gel (250 mm x 4,6 mm, 5 mm) ACE 5 C18 hoặc tương đương;

- pha động:

dung môi A (amoni axetat 0,02 mol/l) và dung môi B (hỗn hợp axetonitril : nước theo tỉ lệ thể tích 7 : 3);

- gradient rửa giải:

tỉ lệ thể tích dung môi A : dung môi B

...

...

...

từ 0 min đến 15 min:          92 : 8 đến 70 : 30

từ 15 min đến 25 min:        70 : 30 đến 40 : 60

từ 25 min đến 30 min:        40 : 60 đến 92 : 8

từ 30 min đến 35 min:        92 : 8;

- nhiệt độ cột:

40 °C;

...

...

...

1,0 ml/min;

- thể tích bơm:

20 ml.

Các chất màu phụ được tách khỏi các thành phần chính và các đồng phân. Chất màu phụ mononatri 3,3'-dioxo-[delta2,2'-biindolin]-5 sulfonat rửa giải ở khoảng 21 min.

5.6.4.3. Dựng đường chuẩn

Bơm năm dung dịch chuẩn làm việc (5.6.2.6) của mỗi đồng phân theo các điều kiện cụ thể nêu trong 5.6.4.2 và tích phân các diện tích pic ở phút thứ 6,5 đối với đồng phân 5,5' (dinatri 3,3'-dioxo-[delta^2,2'- biindolin]-5,5'-disulfonat) và ở phút thứ 10,8 đối với đồng phân 5,7' (dinatri 3,3'-dioxo-[delta^2,2'-biindolin]- 5,7'-disulfonat).

Dựng đường chuẩn của diện tích píc theo nồng độ của mỗi chất chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml).

5.6.4.4. Phép xác định

Bơm các dung dịch mẫu thử s_A, s₁ và s₅. Diện tích píc của đồng phân 5,7' trong dung dịch mẫu thử phải tuyến tính trên đường chuẩn, nếu không, phải tăng thể tích V_s5. Dung dịch mẫu thử s₁, s₅ và s_A được dùng để định lượng lần lượt từng đồng phân 5,5', đồng phân 5,7' và các chất màu phụ.

...

...

...

Tính nồng độ của đồng phân 5,5', C_5,5', biểu thị bằng phần trăm khối lượng, theo công thức sau:

Tính nồng độ của đồng phân 5,7', C_5,7', biểu thị bằng phần trăm khối lượng, theo công thức sau:

Tính nồng độ của các chất màu phụ, C_sub, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, theo công thức sau:

Trong đó:

A_5,5' là diện tích píc của đồng phân 5.5' trên sắc đồ;

A_5,7' là diện tích píc của đồng phân 5,7' trên sắc đồ;

...

...

...

b_5,5' và b_5,7' lần lượt là hệ số tuyến tính của đường chuẩn đối với đồng phân 5,5' và đồng phân 5,7';

m_5,5' và m_5,7' lần lượt là độ dốc của đường chuẩn (đơn vị diện tích: ml/mg) đối với đồng phân 5,5' và đồng phân 5,7';

w_s là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

v là thể tích dung dịch mẫu thử s_A, tính bằng mililit (ml);

v_s1 là thể tích dung dịch mẫu thử s₁, tính bằng mililit (ml);

v_s5 là thể tích dung dịch mẫu thử s₅, tính bằng mililit (ml);

v_s là thể tích dung dịch mẫu thử sau khi pha loãng, tính bằng mililit (trong trường hợp này v_s = 50 ml).

5.7. Xác định hàm lượng các hợp chất hữu cơ không phải là chất màu, theo 3.11 trong TCVN 6470:2010.

Gradient rửa giải HPLC: từ 2 % đến 100 % với tốc độ 4 % mỗi phút (tuyến tính), sau đó rửa giải ở 100 %;

...

...

...

5.9. Xác định hàm lượng các chất chiết được bằng ete, theo 3.6 trong TCVN 6470:2010, sử dụng 2 g mẫu thử.

5.10. Xác định hàm lượng chì, theo TCVN 8900-6:2012 hoặc TCVN 8900-8:2012.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9951:2013 về Phụ gia thực phẩm – Chất tạo màu – Indigotine