7. Tiến hành thử nghiệm

7.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Thêm 10 ml nước (3.13), 1 ml HCl 1 N (3.20) vào từng lọ mẫu. Lắc trong 15 giây (4.5), sau đó lắc 15 min trên máy lắc mẫu (4.4) ở tốc độ 300 r / min. Tiếp theo, thêm cho 400 mL 2-nitrobenzaldehyt 0,05 M (3.21) vào tất cả các mẫu. Lắc 15 giây (4.5), sau đó ủ bằng tủ ấm (4.9) ở 60 °C trong 3 h hoặc ở 37 °C trong 16 h.

Sau khi ủ, lấy ra để cho mẫu trở về nhiệt độ phòng. Sau khi mẫu đã trở về nhiệt độ phòng, cho vào mỗi mẫu 10 ml n-Hexan (3.18). Lắc 15 giây ở (4.5). Ly tâm mẫu ở 3000 vòng trong 5 min (4.3). Loại bỏ lớp trên và lập lại bước này lần 2.

Tiếp theo cho vào mỗi mẫu 1 ml NaOH 1 N (3.23), 2 ml K₂HPO₄ 0,1 M (pH = 7,4) (3.22) và lắc đều. Tiếp theo, thêm 20 ml ethyl acetate (3.14). Lắc trong 5 giây ở (4.5), sau đó lắc đảo lộn 20 lần. Ly tâm mẫu ở 3000 vòng trong 5 min (4.3). Hút lớp trên vào bình quả lê 50 ml (4.7). Sau đó cho 10 ml ethyl acetate (3.14) vào và lập lại bước này. Thu lớp ethyl acetate gộp vào bình quả lê (4.7), sau đó làm khô bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 45 °C (4.6).

Hòa tan phần cặn bằng 0,5 ml dung dịch hòa tan mẫu methanol: Amonium formate (3.30). Lắc trong 30 giây ở (4.5). Dịch thu được lọc qua đầu lọc 0,45 mm (4.15) vào lọ đựng mẫu (4.14) để phân tích sắc ký.

7.2. Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS-MS

7.2.1. Điều kiện HPLC

- Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 mm, độ dài của cột là 50 mm;

...

...

...

- Thể tích bơm mẫu: 10 ml;

- Thời gian phân tích: 4 min;

- Tốc độ dòng: 0,4 ml / min;

Pha động: chương trình gradient thể hiện theo bảng 2.

Bảng 2 - Chương trình pha động

Thời gian
(min)

A %
(Methanol LC/MS)

B %
(Dung dịch ammonium formate 1 mM)

0

...

...

...

45

2,0

55

45

2,1

90

10

3,5

90

...

...

...

3,6

55

45

7.2.2. Điều kiện trên MS

Điều kiện trên MS như sau:

Kiểu ion hóa: ESI (+);

Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150 ^oC;

Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 ^oC;

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 600 l / h;

...

...

...

Các điều kiện phân ly MS/MS như sau:

Bảng 3 - Điều kiện phân ly MS/MS

Thành phần

lon sơ cấp (m/z)

lon thứ cấp (m/z)

Năng lượng mặt nón
(V)

Năng lượng va chạm
(eV)

NPAMOZ

335

...

...

...

291 (*)

24

24

16

11

NPAMOZ-d₅

340

296

24

...

...

...

NPAOZ

236

104(*)

134

24

24

20

12

NPAOZ-d₄

...

...

...

104

24

20

NPSEM

209

166 (*)

192

20

20

...

...

...

12

NP IS-SEM

212

169

20

9

NPAHD

249

194

...

...

...

20

20

11

16

NP-AHD-d₂

251

180

20

16

...

...

...

7.3. Trình tự bơm mẫu

7.3.1. Bơm dung môi kiểm tra máy, dung dịch hòa tan mẫu (3.201);

7.3.2. Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;

7.3.3. Bơm mẫu trắng;

7.3.4. Bơm mẫu kiểm soát;

7.3.5. Bơm mẫu thử.

8. Tính toán và biểu thị kết quả

8.1. Tính hệ số tín hiệu

Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình:

...

...

...

RF: hệ số tín hiệu;

Sp: tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích;

Sp_IS: diện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội tương ứng.

8.2. Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn cho vào mẫu thực được chuẩn bị mẫu theo mục 6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b.

Trong đó:

- RF: Hệ số tín hiệu, tính theo mục 8.1;

- x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 6.4;

- b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

...

...

...

Phương trình đạt yêu cầu khi hệ số hồi quy R² ≥ 0,99.

8.3. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu

Dư lượng chất cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 8.2. Nồng độ trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C: là nồng độ chất phân tích có trong mẫu, tính bằng mg / kg;

C_x: là nồng độ chất phân tích đo được suy ra từ đường chuẩn, mg /l;

V: là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng ml;

F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

...

...

...

8.4. Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị mg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

- Độ lập lại của phương pháp;

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Quy trình chuyển giao phương pháp phân tích chất chuyển hóa của nitrofuran trong mật ong của Cơ quan dịch vụ phân tích quốc tế (QSI) - Cộng hòa liên bang Đức;

[2] Nitrofuran metabolites in Honey. Standard Operating Procedure, # M-H220. JR laboratories Inc.

[3] Decision 2002/657/ CE.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9781:2013 (ISO 834-3:1994) về Mật ong - Xác định dư lượng các chất chuyển hóa của nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS