7. Tiến hành thử nghiệm

7.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Cho 2,0 ml nước (3.4) vào từng lọ mẫu. Trộn đều bằng máy lắc (4.11) trong 30 s. Tiếp theo, thêm vào mỗi ống 8 ml Ethylacetate (3.6). Sau đó lắc bằng máy lắc ngang (4.12) ở tốc độ 300 r / min trong 10 min. Sau khi lắc mẫu, ly tâm ở tốc độ 4000 r / min trong 5 min ở nhiệt độ 4 °C (4.6). Dùng pipet, chuyển 6 ml lớp trên sang ống nghiệm thủy tinh (4.3). Sau đó cho bay hơi bằng bộ bay hơi N₂ (4.9) đến khô ở nhiệt độ 40 °C.

Sau khi bay hơi tới khô, hòa tan lại bằng 0,6 ml n-Hexan (3.7) và 0,45 ml nước (3.4). Trộn đều bằng máy lắc trong trong 30 s (4.11), ly tâm ở 4000 r/min trong 5 min (4.6). Sau đó loại bỏ lớp trên. Hút lớp dưới, lọc qua màng lọc 0,2 μm (4.14) vào lọ đựng mẫu (4.13).

7.2. Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS-MS

7.2.1. Điều kiện HPLC

- Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 μm, độ dài của cột là 50 mm;

- Nhiệt độ cột theo nhiệt độ phòng;

- Thể tích bơm mẫu: 10 μl;

...

...

...

- Tốc độ dòng toàn phần: 0,3 ml / min;

Pha động: chương trình gradient thể hiện theo bảng 2:

Bảng 2 - Chương trình pha động

Thời gian
(min)

Tốc độ dòng
(μL/min)

Pha động A
(%)

Pha động B
(%)

0,1

300

...

...

...

20

2,0

300

50

50

3,0

300

80

20

...

...

...

Điều kiện trên MS như sau:

Kiểu ion hóa:

ESI (-);

Nhiệt độ nguồn ion hóa:

120°C;

Nhiệt độ hóa hơi dung môi:

400 °C;

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi:

500 l / h;

...

...

...

30 I / h.

Các điều kiện phân ly MS-MS như sau:

Bảng 3 - Điều kiện phân ly MS-MS

Tên hợp chất

Ion sơ cấp
(m/z)

Ion thứ cấp
(m/z)

Năng lượng mặt nón
(V)

Năng lượng va chạm
(eV)

CAP

...

...

...

152 (*)

-18

15

321

257

-18

20

CAP-d₅

...

...

...

157

-18

15

GHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) là ion dùng để định lượng.

7.3. Trình tự bơm mẫu

7.3.1. Bơm dung môi kiểm tra máy: Nước (3.4);

7.3.2. Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;

7.3.3. Bơm mẫu trắng;

7.3.4. Bơm mẫu kiểm soát;

...

...

...

8. Tính toán và biểu thị kết quả

8.1. Tính hệ số tín hiệu

Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình:

Trong đó:

RF: hệ số tín hiệu;

Sp: tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích;

Sp_IS: diện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội tương ứng.

8.2. Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu và chuẩn bị mẫu theo mục 6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b. Trong đó:

...

...

...

- x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 6.4;

- b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

- a: hệ số góc của đường chuẩn.

Phương trình đạt yêu cầu khi hệ số hồi quy R² ≥ 0.99.

8.3. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu

Dư lượng chloramphenicol cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 8.2. Nồng độ trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C: là nồng độ chloramphenicol có trong mẫu, tính bằng μg / kg;

...

...

...

V: là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng ml;

F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

a: là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8.4. Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;

...

...

...

- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

- Độ lập lại của phương pháp;

- Kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] AFSSA-FOUGERES: Chloramphenicol identification by liquid chromatography tandem mass- spectrometry, 35133 France.

[2] A confirmatory method for the determination of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol in honey, Waters Applications Note.

[3] Decision 2002/657/ EC of August 2002.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9780:2014 về Mật ong - Xác định dư lượng chloramphenicol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS