5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau đây:

5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến ± 0,001 g.

5.2. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì được ở 70 °C ± 1 °C.

5.3. Bộ phân phối, dùng cho hỗn hợp chiết metanol/nước (4.4), và cài đặt ở mức 5,0 ml.

5.4. Máy ly tâm, có lực ly tâm tương đối (R.C.F.) 2 000 (điển hình 3 500 r/min).

5.5. Máy đo quang phổ, cài đặt ở bước sóng 765 nm và có thể phù hợp với các cuvet có chiều dài đường quang 10 mm, tốt nhất là dùng cuvet dòng chảy tự động.

5.6. Pipet, thủy tinh hoặc tự động, có các dung tích bao trùm dải thể tích dùng cho chất chuẩn và các dịch pha loãng của dịch chiết mẫu.

5.7. Bình định mức một vạch, các dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1 l.

...

...

...

5.9. Ống chiết, bằng thủy tinh, dung tích 10 ml, được đậy kín và có thể chịu được khi ly tâm.

5.10. Ống chia độ, bằng thủy tinh, dung tích 10 ml, chia độ 0,1 ml.

Do phép phân tích nhạy với các tạp chất hữu cơ dạng vi lượng nên cần thực hiện quy trình làm sạch bổ sung đối với tất cả các ống chiết (5.9) và ống chia độ (5.10), rửa bằng axit nitric khoảng 15 % (thể tích), sau đó tráng kỹ bằng nước và làm khô trong tủ sấy ở 100 °C. Trong phép phân tích đo màu cuối cùng, nên sử dụng ống bằng chất dẻo dùng một lần thay cho việc dùng ống chia độ vì không cần phải làm sạch bổ sung.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo:

- TCVN 5609 (ISO 1839) đối với chè, và

- TCVN 9743 (ISO 7516) đối với chè hòa tan.

7. Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

Đối với chè hòa tan, chỉ yêu cầu nghiền đối với các mẫu có cấu trúc dạng hạt thô.

8. Cách tiến hành

8.1. Yêu cầu chung

Nếu có yêu cầu kiểm tra giới hạn lặp lại (10.2) thì tiến hành hai phép xác định đơn lẻ theo 8.2 đến 8.6 dưới các điều kiện lặp lại.

8.2. Xác định hàm lượng chất khô

Tính hàm lượng chất khô từ độ ẩm xác định được (hao hụt khối lượng ở 103 °C) trên phần mẫu thử (Điều 7) theo:

- TCVN 9738 (ISO 1572) đối với chè, hoặc

- TCVN 9741 (ISO 7513) đối với chè hòa tan.

8.3. Phần mẫu thử

...

...

...

Cân (0,500 ± 0,001) g mẫu thử (Điều 7) cho vào bình định mức một vạch 50 ml.

8.3.2. Chè

Cân (0,200 ± 0,001) g mẫu thử (Điều 7) cho vào ống chiết (5.9).

8.4. Chiết các polyphenol

8.4.1. Chè hòa tan

8.4.1.1. Cho khoảng 25 ml nước nóng (nhiệt độ tối đa 60 °C) vào chè hòa tan đựng trong bình định mức (8.3.1). Trộn đều để hòa tan mẫu và để nguội đến nhiệt độ phòng.

8.4.1.2. Thêm 5,0 ml axetonitril (4.2). Pha loãng đến vạch bằng nước và trộn.

8.4.2. Chè

8.4.2.1. Cho hỗn hợp chiết metanol/nước (4.4) đựng trong bộ phân phối (5.3) vào nồi cách thủy đặt ở 70 °C và để trong ít nhất 30 min để cho hỗn hợp chiết cân bằng.

...

...

...

8.4.2.3. Tiếp tục đun nóng ống chiết 10 min trong nồi cách thủy, trộn trên máy trộn vortex sau 5 min đến 10 min.

Điều quan trọng là trộn đều kỹ các mẫu để đảm bảo chiết hết.

8.4.2.4. Lấy ống chiết ra khỏi nồi cách thủy và để nguội đến nhiệt độ phòng. Mở nắp và đặt ống vào máy ly tâm (5.4) ở tốc độ 3 500 r/min trong 10 min.

8.4.2.5. Gạn cẩn thận dịch nổi phía trên vào ống chia độ (5.10).

8.4.2.6. Lặp lại các bước chiết 8.4.2.2 đến 8.4.2.5. Phối trộn các dịch chiết, thêm hỗn hợp chiết nguội metanol/ nước (4.4) đến 10 ml và trộn.

8.4.2.7. Dịch chiết từ 8.4.2.6 có thể bền ít nhất trong 24 h nếu được bảo quản ở 4 ºC. Để cho dịch chiết đạt đến nhiệt độ phòng trước khi tiến hành phép phân tích. Nếu chỉ một lượng nhỏ mẫu dạng hạt có thể bị lắng xuống trong quá trình bảo quản thì không cần phải tái huyền phù.

8.5. Dịch pha loãng

Dùng pipet chuyển 1,0 ml dịch chiết mẫu (dịch chiết chè hòa tan từ 8.4.1.2 hoặc dịch chiết chè từ 8.4.2.6) vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng đến vạch bằng nước và trộn.

8.6. Xác định

...

...

...

CHÚ THÍCH: Dung dịch này tương ứng với khoảng 10 µg, 20 µg, 30 µg, 40 µg và 50 µg axit gallic khan.

8.6.2. Dùng pipet thực hiện hai lần, mỗi lần chuyển 1,0 ml nước vào các ống chia độ (5.10). Đây là mẫu trắng thuốc thử.

8.6.3. Dùng pipet thực hiện hai lần, mỗi lần chuyển 1,0 ml dịch chiết mẫu pha loãng (8.5) vào các ống chia độ riêng rẽ.

8.6.4. Dùng pipet thêm 5,0 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (4.6) vào từng ống và trộn.

8.6.5. Sau khi bổ sung thuốc thử Folin-Ciocalteu loãng trong vòng 3 min đến 8 min, dùng pipet lấy 4,0 ml dung dịch natri cacbonat (4.7) vào mỗi ống. Đậy nắp và trộn.

8.6.6. Để yên bình ở nhiệt độ phòng trong 60 min, sau đó đo mật độ quang trong cuvet có chiều dài đường quang 10 mm so với nước trên máy đo quang phổ (5.5) đặt ở bước sóng 765 nm.

8.6.7. Mẫu trắng thuốc thử (8.6.2) phải có mật độ quang < 0,010. Các giá trị mẫu trắng cao hơn cho thấy có sự nhiễm từ nước, thuốc thử hoặc dụng cụ thủy tinh. Điều quan trọng nữa là mật độ quang của mẫu phải nằm trong dải hiệu chuẩn. Nếu mật độ quang của mẫu cao hơn mật độ quang của 50 µg dung dịch chuẩn axit gallic E thì lặp lại phép phân tích đo màu bằng cách tăng độ pha loãng (8.5).

9. Tính kết quả

9.1. Tính khối lượng của axit gallic khan, m, trong 1,0 ml dịch lỏng của dung dịch chuẩn A, B, C, D và E (4.9) từ 8.6.1, chính xác đến 0,1 µg, dùng công thức:

...

...

...

Trong đó

m₀ là khối lượng của axit gallic ngậm một phân tử nước, được dùng để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc (4.8), tính bằng gam (g);

V là thể tích của dung dịch chuẩn gốc axit gallic, được dùng để chuẩn bị các dung dịch chuẩn A, B, C, D và E (4.9), tính bằng mililit (ml);

w_{DM, chuẩn} là hàm lượng chất khô của axit gallic, tính bằng phần trăm khối lượng (%).

9.2. Dựng đường chuẩn tuyến tính phù hợp nhất từ khối lượng của axit gallic khan trong các chất chuẩn A, B, C, D và E (4.9), như đã tính trong 9.1, dựa vào mật độ quang của dung dịch chuẩn axit gallic sau khi trừ đi mật độ quang của mẫu trắng thuốc thử.

Thu lấy giá trị độ dốc của đường chuẩn và giá trị giao điểm. Đường chuẩn axit gallic điển hình được nêu trong Phụ lục A.

Phải thu được hiệu chuẩn tuyến tính. Tính giá trị độ dốc của đường chuẩn, chính xác đến 0,0001 để dùng cho các phép tính tiếp theo. Hiệu chuẩn tuyến tính cũng phải có giá trị giao điểm gần với giá trị ban đầu. Các giá trị giao điểm trên mật độ quang của trục y > ± 0,04 phải được kiểm tra đánh giá. Ví dụ, kiểm tra độ ẩm của axit gallic, việc chuẩn bị chất chuẩn hoặc hiệu chuẩn pipet.

Hàm lượng polyphenol tổng số, w_T, tính bằng phần trăm khối lượng mẫu khô, được tính bằng công thức:

w_T =

...

...

...

D_mẫu là mật độ quang thu được đối với dung dịch mẫu thử;

D_{giao điểm} là mật độ quang tại điểm đường chuẩn tuyến tính phù hợp nhất cắt với trục y;

S_chuẩn là độ dốc thu được từ hiệu chuẩn tuyến tính phù hợp nhất;

m_mẫu là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V_mẫu là thể tích của dịch chiết mẫu (50 ml đối với chè hòa tan và 10 ml đối với chè), tính bằng mililit (ml);

d là hệ số pha loãng được dùng trước khi xác định phép đo màu (điển hình từ 1,0 ml đến 100 ml, vì vậy hệ số pha loãng là 100);

w_DM,mẫu  là hàm lượng chất khô của mẫu thử, xác định được theo 8.2, tính bằng phần trăm khối lượng (%).

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

...

...

...

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được, khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên cùng vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % trường hợp vượt quá giá trị giới hạn lặp lại, r, nêu trong Bảng B.1.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai kết quả thử đơn lẻ thu được, khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên cùng vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % trường hợp vượt quá giá trị giới hạn tái lập, R, nêu trong Bảng B.1.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

...

...

...

- kết quả thử nghiệm thu được;

- nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Đường chuẩn của axit gallic

X Hàm lượng của axit gallic khan, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml)

Y Mật độ quang, 765 nm

...

...

...

R² = 0,998 5

Giá trị độ dốc của đường chuẩn = 0,013 2

Giá trị giao điểm = 0,011 3

Hình A.1 - Đường chuẩn tuyến tính phù hợp nhất đối với axit gallic

Phụ lục B

(tham khảo)

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Một phép thử liên phòng thử nghiệm được thực hiện vào năm 2001, dưới sự bảo trợ của Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế, cho các kết quả thống kê [được đánh giá theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)] nêu trong Bảng 1.

...

...

...

Nhận biết mẫu

Chè xanh
A

Chè đen
B

Chè đen
C

Số lượng các phòng thử nghiệm tham gia

23

23

23

Số lượng các kết quả thử nghiệm được chấp nhận

...

...

...

20

20

Hàm lượng polyphenol tổng số trung bình, tính theo hàm lượng chất khô, %

24,35

18,81

13,95

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r

0,332

0,218

...

...

...

Hệ số biến thiên lặp lại, %

1,36

1,16

1,53

Giới hạn lặp lại, r(=2,8 s_r)

0,93

0,61

0,60

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R

...

...

...

1,186

1,029

Hệ số biến thiên tái lập, %

4,64

6,31

7,38

Giới hạn tái lặp, R(=2,8 s_R)

3,16

3,32

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 5609:2007 (ISO 1839:1980), Chè - Lấy mẫu

[2] TCVN 9743:2013 (ISO 7516:1984), Chè hòa tan dạng rắn - Lấy mẫu

[3] TCVN 6910-2:2010 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[4] SINGLETON, V.L., ORTHOFER, R. and LAMUELA-RAVENTOS, R.M. Analysis of total phenolics and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. In: Methods in Enzymology.Oxidants and Antioxidants, Part A, Lester Packer, ed. (1999) 299, pp. 152-178

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005, Đính chính kỹ thuật 1:2006) về Chè - Xác định các chất đặc trưng của chè xanh và chè đen - Phần 1 - Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè - Phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu