10.2.2. Nhiệt độ của buồng bơm và detector phải là 250 °C.

10.3. Kiểm tra hiệu năng

Bơm từ 0,5 ml đến 1,0 ml metyl este (nồng độ khoảng 7 mg/ml trong n-heptan) của mẫu thử vào máy sắc kí khí. So sánh kết quả của mẫu loại tương tự với sắc đồ điển hình nêu trong Phụ lục B.

Có thể cần thay đổi nhỏ về nhiệt độ lò nếu phần tách thu được không giống với sắc đồ điển hình. Tăng hoặc giảm nhiệt độ lò theo từng bước 1 °C cho đến khi hiệu quả tách tốt. Những hiệu chỉnh nhỏ này có thể cần để khắc phục sự khác nhau giữa các cột và kiểm soát nhiệt độ thiết bị, và thường nằm trong dải (cộng hoặc trừ) một vài độ so với mức tối đa từ giá trị đã cho.

Nếu nhiệt độ lò tăng (xem [4]) thì pic C20:1 cis sẽ được rửa giải sớm hơn, liên quan đến axit linolenic C18:3 9cis, 12cis, 15 cis (ccc).

CHÚ THÍCH 1 Các đặc tính của pha tĩnh BPX-70 có phần khác nhau, dẫn đến rửa giải pic C20:1 cis sau pic C18:3 9cis. 12cis, 15cis, khi sử dụng các điều kiện này (so sánh với Phụ lục B).

Nếu hệ thống GC được cài đặt đúng thì sau khi tách phải nhận biết được một lượng nhỏ đồng phân C18:1 11cis cạnh pic C18:1 9cis trong dầu tinh luyện (nhiệt độ cao), ví dụ: dầu đậu tương. Hai đồng phân C18:1 cis cần được tách rõ (xem Phụ lục B).

CHÚ THÍCH 2 Dầu marine đã hydro hóa có thể làm tăng dải các đồng phân trans rộng hơn, làm cho việc nhận biết và định lượng khó hơn.

Đồng phân tự nhiên C20:1 cis cần ở chính giữa pic đồng phân C18:3 trans (tcc) rửa giải cuối cùng và pic C18:3 ccc (axit linolenic) trong dầu tinh luyện (nhiệt độ cao).

...

...

...

Đối với dầu và mỡ đã hydro hóa từng phần thì việc tách các đồng phân C18:1 13trans và C18:1 9cis có thể thấy trên sắc đồ. Điều này cần thiết cho việc tách pic chính xác các đồng phân cis với trans (xem Phụ lục B).

Đồng phân 18:1 13trans luôn rửa giải cùng với đồng phân 18:1 14trans. Do đó, pic của hai đồng phân này được nhận biết như là 18:1 (13+14)trans.

10.4. Nhận biết pic

Đối với dầu và chất béo tinh luyện (nhiệt độ cao) thì có ít đồng phân trans, vì chỉ có các đồng phân hình học với liên kết đôi ở cùng vị trí tự nhiên được hình thành. Các đồng phân đặc thù này là kiểu C18 của các axit béo: C18:1 9trans, C18:2 9c12t và C18:2 9t12c và với các đồng phân C18:3 tct, cct, ctc, và tcc 9,12, 15 (trong một số mẫu các đồng phân C18:2 9t12t và C18:3 ttc cũng được tìm thấy với các lượng rất nhỏ).

Đối với dầu và mỡ đã hydro hóa một phần thì các đồng phân chứa liên kết đôi trans được nhận biết sử dụng khái niệm chiều dài mạch tương đương (ECL) (xem Tài liệu tham khảo [5,6]). Để nhận biết pic chính xác bằng hệ thống này thì các giá trị ECL phải được xác định sau khi hiệu chỉnh thích hợp với các chuẩn đồng phân axit béo cis và trans có sẵn5⁾, (xem Phụ lục C).

Mẫu đầu tiên trong mẻ phân tích luôn là một mẫu trắng (n-heptan). Mẫu trắng không được có pic nào. Cứ sau mười mẫu thì lặp lại phép thử trắng.

Đối với một mẻ phân tích (nghĩa là metyl hóa xảy ra trong một mẻ), cần phân tích ít nhất một mẫu chuẩn (5.2) để kiểm tra tính năng metyl hóa và phân tách GC. Các axit béo đã metyl hóa của vật liệu chuẩn được bơm sau mỗi dãy mười mẫu thử.

11. Tính kết quả

11.1. Yêu cầu chung

...

...

...

Sử dụng vật liệu chuẩn BCR (xem 5.2) để xác định các hệ số hiệu chính riêng rẽ.

11.2. Tính hệ số đáp ứng FID

Tính hệ số đáp ứng FID đối với từng thành phần bằng công thức sau:

Trong đó:

F_x là hệ số đáp ứng FID của thành phần x;

M_x là khối lượng phân tử của thành phần x;

n_x là số lượng nguyên tử cacbon của thành phần axit béo đã metyl hóa x;

A_C là khối lượng nguyên tử cacbon (A_C = 12,01).

...

...

...

11.3 Tính hệ số hiệu chính FID

Tính hệ số hiệu chính FID đối với mỗi thành phần bằng công thức sau:

Trong đó:

f_x là hệ số hiệu chính đối với thành phần x;

F_x là hệ số đáp ứng FID đối với thành phần x;

F_r là hệ số đáp ứng FID đối với C16:0 (F_r = 1,407).

Hệ số đáp ứng FID đối với C16:0 (F_r = 1,407) được coi là chuẩn (f_x = 1,00). Tất cả hệ số đáp ứng FID đã hiệu chính khác sử dụng trong tính toán đều tính theo giá trị này. Ví dụ, hệ số đáp ứng hiệu chính đối với C10:0 là 1,10. Xem Phụ lục D về danh mục các hệ số FID.

11.4. Tính phần khối lượng tương đối

...

...

...

Trong đó:

w_x là phần khối lượng tương đối của thành phần x, tính bằng phần trăm diện tích pic;

A_x là diện tích của pic tương ứng với thành phần x, tính bằng đơn vị diện tích;

A_t, là tổng diện tích hiệu chính của tất cả các pic, không bao gồm pic của dung môi, tính bằng đơn vị diện tích;

f_x là hệ số hiệu chính đối với thành phần X.

11.5. Tính hàm lượng của các đồng phân axit béo dạng trans

11.5.1. Dầu và mỡ tinh luyện (nhiệt độ cao)

Tính hàm lượng các đồng phân axit béo trans của dầu và mỡ tinh luyện (nhiệt độ cao) là tổng của các phần khối lượng tương quan của metyl este axit béo C18:1 trans, C18:2 trans và C18:3 trans, liên quan đến tất cả các metyl este axit béo. Số pic tối đa có thể thu được là: C18:1 trans (1 pic), C 18:2 trans (2 pic) và C18:3 trans (4 pic). Xem Hình A.4 và A.5.

...

...

...

11.5.2. Dầu và mỡ đã hydro hóa từng phần

Tính hàm lượng các đồng phân axit béo dạng trans của dầu và mỡ đã hydro hóa từng phần là tổng của các phần khối lượng tương đối của tất cả các metyl este axit béo chứa liên kết đôi trans, liên quan đến các metyl este axit béo.

Báo cáo kết quả chính xác đến 0,1 % (khối lượng).

12. Độ chụm

12.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục E. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và các chất nền đã nêu.

CHÚ THÍCH Một vài loại dầu đã hydro hóa từng phần có thể có các mức axit béo dạng trans nằm ngoài dải thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm.

12.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn độ lặp lại r đưa ra trong Bảng 2.

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn độ tái lập R đưa ra trong Bảng 2.

Bàng 2 - Giới hạn lặp lại (r) và giới hạn tái lập (R)

Mẫu

Hàm lượng trung bình của các đồng phân axit béo dạng trans

% (khối lượng)

r

% (khối lượng)

R

% (khối lượng)

...

...

...

0,34

0,08

0,21

Dầu đậu tương

0,78

0,13

0,31

Dầu hạt nho

1,09

...

...

...

0,40

13. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được;

- kết quả cuối cùng thu được, nếu kiểm tra độ lặp lại.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU

Xem các Hình từ A.1 đến A.3.

Nhận biết pic

1          monoenoic-trans

2          monoenoic-cis

Hình A.1 - Các điều kiện tối ưu đối với cột BPX-70, ở 198 °C (đẳng nhiệt), mẫu BO35

...

...

...

Nhận biết pic

1          monoenoic-trans

2          monoenoic-cis

Hình A.2 - Các điều kiện tối ưu đối với cột CP-Sil 88, ở 175 °C (đẳng nhiệt), mẫu BO35

Nhận biết pic

1          monoenoic-trans

2          monoenoic-cis

Hình A.3 - Các điều kiện tối ưu đối với cột SP-2340, ở 192 °C (đẳng nhiệt), mẫu BO35

...

...

...

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ CÁC SẮC ĐỒ ĐIỂN HÌNH THU ĐƯỢC TRONG CÁC ĐIỀU KIỆN KHUYẾN CÁO

Xem các Hình từ B.1 đến B.5.

CHÚ THÍCH: Sử dụng cột 50 m x 0,25 mm x 0,20 mm CP^TM-Sil 88 (Chrompack) ở 175 °C (đẳng nhiệt). Các diện tích lưu đồng phân axit béo cis và trans được chỉ ra trên sắc đồ.

Hình B.1 - Sắc đồ của metyl este từ mẫu dầu đậu tương hydro hóa từng phần

CHÚ THÍCH: Sử dụng cột 60 m x 0,25 mm x 0,20 mm SP-2340 (Supelco) ở 190 °C (đẳng nhiệt). Các diện tích lưu đồng phân axit béo cis và trans được chỉ ra trên sắc đồ.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Sử dụng cột 50 m x 0,22 mm x 0,25 mm BPX-70 (SGE) ở 198 °C (đẳng nhiệt). Các diện tích lưu đồng phân axit béo cis và trans được chỉ ra trên sắc đồ.

Hình B.3 - Sắc đồ của metyl este từ mẫu dầu đậu tương hydro hóa từng phần

CHÚ THÍCH: Sử dụng cột 50 m x 0,25 m x 0,20 mm CP™-Sil 88 (Chrompack) ở 175 °C (đẳng nhiệt). Các pic đồng phân axit béo cis và trans được tô đậm màu.

Hình B.4 - Sắc đồ của metyl este từ mẫu dầu hạt nho hydro hóa từng phần

CHÚ THÍCH: Sử dụng cột 50 m x 0,22 mm x 0,25 mm BPX-70 (SGE) ở 198 °C (đẳng nhiệt). Các pic đồng phân axit béo cis và trans được tô đậm màu.

Hình B.5 - Sắc đồ của metyl este từ mẫu dầu hạt nho tinh luyện ở nhiệt độ cao

...

...

...

(Tham khảo)

CÁC GIÁ TRỊ CHIỀU DÀI MẠCH TƯƠNG ĐƯƠNG (ECL)

Đồng phân C18

Pha tĩnh và nhiệt độ

SP-2340

192 °C

CP™-Sil 88

175 °C

BPX-70

...

...

...

C18:1

6cis

18,58

7cis

18,58

...

...

...

9cis

18,68

18,66

18,46

10cis

...

...

...

11cis

18,76

18,74

18,53

12cis

18,80

...

...

...

13cis

18,87

15cis

19,00

...

...

...

6trans

18,41

7trans

18,42

...

...

...

9trans

18,49

18,46

18,28

10trans

18,49

...

...

...

11trans

18,52

12trans

18,57

...

...

...

13trans

18,61

15trans

18,66

...

...

...

C18:2

9c12c

19,62

19,63

19,14

9c12t

19,40

19,40

...

...

...

9t12c

19,48

19,49

19,02

9t12t

19,26

19,20

...

...

...

12c15c

19,92

C18:3

6c9c12c

20,28

...

...

...

9t12t15t

20,04

9t12c15t

20,23

20,26

...

...

...

9c12c15t

20,35

20,36

19,61

9c12t15c

20,53

...

...

...

9t12c15c

20,57

20,56

19,82

9c12c15c

20,68

20,67

...

...

...

CHÚ THÍCH 1: Các đồng phân axit béo quan trọng nhất được xác định ở Unilever Research Vlaardingen, trên ba pha tĩnh phân cực cao và các điều kiện tối ưu đưa ra.

CHÚ THÍCH 2: Đối với cơ sở dữ liệu, xem Tài liệu tham khảo [5] và [6].

PHỤ LỤC D

(Tham khảo)

Hệ số đáp ứng FID và hệ số hiệu chính FID

Metyl este (x) của cacbon axit béo

Số.

M_x^a

...

...

...

F_x^a

f_x^a

4:0

102,13

4

2,126

1,51

6:0

130,19

...

...

...

1,807

1,28

8:0

158,24

8

1,647

1,17

9:0

172,27

...

...

...

1,594

1,13

10:0

186,30

10

1,551

1,10

11:0

200,32

...

...

...

1,516

1,08

12:0

214,35

12

1,487

1,06

13:0

228,37

...

...

...

1,463

1,04

14:0

242,40

14

1,442

1,02

15:0

256,42

...

...

...

1,423

1,01

16:0

270,46

16

1,407

1,00 (đối chứng)

17:0

284,49

...

...

...

1,393

0,99

18:0

298,52

18

1,381

0,98

19:0

312,52

...

...

...

1,370

0.97

20:0

326,57

20

1,360

0,97

21:0

340,57

...

...

...

1,350

0,96

22:0

354,62

22

1,342

0,95

23:0

368,62

...

...

...

1,334

0,95

24:0

382,68

24

1,328

0,94

a M_x là khối lượng phân tử tương đối của thành phần x;

n_x là số nguyên tử cacbon của thành phần axit béo đã metyl hóa x;

...

...

...

f_x là hệ số hiệu chính đối với thành phần x.

PHỤ LỤC E

(Tham khảo)

CÁC KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Độ chụm của phương pháp được thiết lập năm 1995 bởi một phép thử liên phòng thử nghiệm được thực hiện theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) [7], và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [8] và NEN 6303 [9]. Trong phép thử này có 60 phòng thử nghiệm tham gia. Kết quả của 38 phòng thử nghiệm được chấp nhận. Sáu mẫu kiểm tra (mẫu mù) được lặp lại hai lần đối với dầu hạt hướng dương, dầu đậu tương và dầu hạt nho (xem Bảng E.1). Kết quả đã được công bố (xem Tài liệu tham khảo [10]).

CHÚ THÍCH Một vài loại dầu đã hydro hóa từng phần có thể có các mức axit béo dạng trans nằm ngoài dải thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm.

Bảng E.1 - Các kết quả phép thử liên phòng thử nghiệm

Thông số

...

...

...

Dầu hạt hướng dương

Dầu đậu tương

Dầu hạt nho

Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

38

38

37

Số lượng được quan sát giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

144

...

...

...

143

Trung bình hàm lượng các đồng phân axit béo dạng trans, % (khối lượng)

0,34

0,78

1,09

Độ lệch chuẩn lặp lại, (s_r), % (khối lượng)

0,029

0,045

0,047

...

...

...

8,64

5,85

4,34

Giới hạn lặp lại (r) r = 2,8 s_r % (khối lượng)

0,08

0,13

0,13

Độ lệch chuẩn tái lập, (s_R), % (khối lượng)

0,077

...

...

...

0,143

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

22,64

14,07

13,14

Giới hạn tái lập (R) R = 2,8 s_R, % (khối lượng)

0,21

0,31

0,40

...

...

...

Bảng E.2 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm trên dầu hạt hướng dương

Thông số

Dầu hạt hướng dương

trans C18:1

trans C18:2

trans C18:3

Tổng các đồng phân trans

Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

39

...

...

...

30

50

Số lượng được quan sát giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

468

612

360

600

Trung bình hàm lượng các đồng phân axit béo dạng trans, % (bẳng khối lượng)

0,029

...

...

...

0,033

0,205

Độ lệch chuẩn lặp lại, (s_r), % (khối lượng)

0,005

0,009

0,007

0,015

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, %

18,47

...

...

...

21,65

7,49

Giới hạn lặp lại (r) r = 2,8 s_r, % (khối lượng)

0,015

0,025

0,020

0,043

Độ lệch chuẩn tái lập, (s_R), % (khối lượng)

0,014

...

...

...

0,013

0,048

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

46,80

19,25

38,96

23,17

Giới hạn tái lập (R) R = 2,8 s_R, % (khối lượng)

0,038

...

...

...

0,036

0,133

Bảng E.3 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm trên dầu hạt nho

Thông số

Dầu hạt nho

trans C18:1

trans C18:2

trans C18:3

Tổng các đồng phân trans

...

...

...

33

48

47

47

Số lượng được quan sát giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

396

576

564

564

...

...

...

0,032

0,074

0,406

0,521

Độ lệch chuẩn lặp lại, (s_r), % (khối lượng)

0,005

0,012

0,015

0,027

...

...

...

15,63

15,93

3,69

5,21

Giới hạn lặp lại (r) r = 2,8 s_r, % (khối lượng)

0,014

0,033

0,042

0,076

...

...

...

0,009

0,020

0,058

0,081

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

29,02

27,03

14,16

15,63

...

...

...

0,026

0,056

0,161

0,228

Bảng E.4 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm trên dầu oliu

Thông số

Dầu oliu

trans C18:1

trans C18:2

...

...

...

Tổng các đồng phân trans

Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

31

36

22

40

Số lượng được quan sát giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

372

432

...

...

...

480

Trung bình hàm lượng các đồng phân axit béo dạng trans, % (bẳng khối lượng)

0,023

0,021

0,016

0,055

Độ lệch chuẩn lặp lại, (s_r), % (khối lượng)

0,005

0,007

...

...

...

0,012

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, %

23,29

34,01

29,02

22,08

Giới hạn lặp lại (r) r = 2,8 s_r, % (khối lượng)

0,015

0,020

...

...

...

0,034

Độ lệch chuẩn tái lập, (s_R), % (khối lượng)

0,009

0,011

0,009

0,030

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

40,37

51,02

...

...

...

54,55

Giới hạn tái lập (R) R = 2,8 s_R, % (khối lượng)

0,026

0,030

0,024

0,084

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 2625 (ISO 5555), Dầu mỡ động vật và thực vật - Lấy mẫu

...

...

...

[3] IUPAC 2.301: Preparation of the fatty acid methyl esters

[4] DUCHATEAU G.S.M.J.E., van OOSTEN H.J. and VASCONCELLOS M.A. Analysis of cis- and trans-fatty acid isomers with capillary GLC in hydrogenated and refined vegetable oils. J. Am. Oil Chem. Soc., 73, 1996, pp. 275-282

[5] SCHOLFIELD C.R Gas chromatographic equivalent Chain lengths of fatty acid methyl esters on a Silar 10C glass capillary column. J. Am. Oil Chem. Soc., 58, 1981, pp. 662-663

[6] RATNAYAKE W.M.N. and PELLETIER G. Positional and geometrical isomers of linoleic acid in partially hydrogenated oils. J. Am. Oil Chem. Soc., 69, 1992, pp. 662-663

[7] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[8] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[9] NEN 6303, Vegetable and animal oils and and fats - Determination of repeatability and reproducibility of methods of analysis by interlaboratory tests

[10] BRUGGEN P.C. van, DUCHATEAU G.S.M.J.E., MOOREN, and OOSTEN H.J. van. Precision of low trans fatty acid level determination in refined oils: Results of a collaborative capillary gas liquid chromatography study. J. Am. Oil Chem. Soc., 75(4), 1998, pp. 483-488

* ISO 5509:2000 đã được thay thế bởi ISO 12966-2:2011, tiêu chuẩn này đã được biên soạn thành TCVN 9675-2:2013 (ISO 12966-2:2011) Dầu mỡ động vật và thực vật - sắc kí khí các metyl este của axit béo - Phần 2: Chuẩn bị metyl este của axit béo.

...

...

...

2 Sản phẩm bán sẵn từ Chrompack, Middelburg, Hà Lan

3 Sản phẩm bán sẵn từ Supelco, Bellafonte, PA, USA.

4 Sản phẩm bán sẵn từ SGE Inc., Austin, Texas. USA.

Các loại cột này là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm đó.

5 Các chuẩn đồng phân axit béo có sẵn từ các nhà cung cấp hóa chất (ví dụ: Nu-Check Prep Inc., US; Sigma, US; Larodan. Thụy Điển).

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9673:2013 (ISO 15304:2002) về Dầu mỡ động vật và thực vật - Xác định hàm lượng các đồng phân axit béo dạng trans của dầu mỡ thực vật - Phương pháp sắc kí khí