Thể tích dịch chiết mẫu được chuyển vào cuvet có thể tăng đến 1,0 ml. Khi đó, đỉnh pH của dịch lọc đến khoảng từ 4 đến 5. Tương ứng giảm thể tích của lượng 1,50 ml nước cần cho vào hỗn hợp phản ứng trong 9.4.5, để thu được thể tích cuối cùng V₁ như nhau trong 9.4.6.

9.4.5. Làm nguội các cuvet đến 22,5⁰C ± 2,5⁰C và làm sạch bên ngoài cuvet. Dùng pipet (6.4) cho liên tiếp vào tất cả các cuvet 1,00 ml dung dịch đệm triethanolamin (5.8), 100 ml dung dịch NADP (5.9), 100 ml dung dịch ATP (5.10) và 1,50 ml nước. Trộn cẩn thận bằng cách xoay cuvet hoặc dùng dao trộn (6.5).

Đọc độ hấp thụ A₁ của từng cuvet bằng máy đo phổ (6.8) ở bước sóng 340 nm so với nước sau 3 min.

9.4.6. Dùng pipet (6.4) cho vào mỗi cuvet 20 ml huyền phù HK/G-6-PDH (5.12). Trộn lượng chứa trong cuvet bằng cách đưa dao trộn lên-xuống. Thể tích cuối cùng trong cuvet là 3,04 ml (V₁).

Đọc độ hấp thụ A₂ của từng cuvet ở bước sóng 340 nm so với nước sau 15 min.

CHÚ THÍCH: Phản ứng thường kết thúc trong vòng 5 min đến 10 min. Nếu phản ứng không dừng lại trong khoảng thời gian này thì đọc độ hấp thụ sau mỗi 2 min cho đến khi độ hấp thụ tăng ổn định. Ngoại suy độ hấp thụ theo thời điểm bổ sung enzym HK/G-6-PDH (ví dụ, xem Hình A.1).

10. Tính kết quả

10.1. Hàm lượng tinh bột không chứa nước

10.1.1. Chênh lệch độ hấp thụ

...

...

...

DA_s = (A­_2s - A_1s) - (A­_2g - A_1g) - (A_­2b­ - A_1b)

Trong đó:

DA_s là chênh lệch độ hấp thụ bởi hàm lượng tinh bột;

A_1b là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng thuốc thử đo được trong 9.4.5;

A_1g là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định glucose đo được trong 9.4.5;

A_1s là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định tinh bột đo được trong 9.4.5;

A_2b là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng thuốc thử đo được trong 9.4.6;

A_2g là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định glucose đo được trong 9.4.6;

A_2s là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định tinh bột đo được trong 9.4.6;

...

...

...

Tính hàm lượng tinh bột không chứa nước theo công thức sau:

w_s =

Trong đó:

w_s là hàm lượng tinh bột không chứa nước của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng;

DA_s là chênh lệch độ hấp thụ tính được trong 10.1.1;

M_rgs là khối lượng phân tử tương đối của glucose trong tinh bột (M_rgs = M_rglucose - M_rwater) = 162,1);

V₁ là thể tích cuối cùng trong cuvet, tính bằng mililit (V₁ = 3,04 ml);

f là hệ số pha loãng;

d là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm);

...

...

...

m là khối lượng phần mẫu thử (9.1), tính bằng gam (g);

V₂ là thể tích của dịch chiết mẫu được bổ sung trong 9.4.3, tính bằng mililit (ml).

Làm tròn kết quả đến hai chữ số thập phân.

10.2. Hàm lượng glucose

10.2.1. Chênh lệch độ hấp thụ

Tính chênh lệch độ hấp thụ bằng công thức sau đây:

DA_g = (A_2g - A_1g) - (A_2b - A_1b)

Trong đó:

DA_g là chênh lệch độ hấp thụ đối với hàm lượng glucose;

...

...

...

A_1g là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định glucose đo được trong 9.4.5;

A_2b là độ hấp thụ của dung dịch trắng thuốc thử đo được trong 9.4.6;

A_2g là độ hấp thụ của dung dịch thử để xác định glucose đo được trong 9.4.6.

10.2.2. Tính hàm lượng glucose

Tính hàm lượng glucose theo công thức sau:

w_g =

trong đó:

w_g là hàm lượng glucose của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng;

DA_g là chênh lệch độ hấp thụ tính được trong 10.2.1;

...

...

...

V₁ là thể tích cuối cùng trong cuvet (V₁ = 3,04 ml), tính bằng mililit (ml);

f là hệ số pha loãng;

d là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm);

k là hệ số hấp thụ phân tử của NADPH, tính bằng lít trên milimol centimet (k = 6,30 l.mmol^-1.cm^-1 khi đo ở bước sóng 340 nm);

m là khối lượng phần mẫu thử (9.1), tính bằng gam (g);

V₂ là thể tích của dịch chiết mẫu được bổ sung trong 9.4.3, tính bằng mililit (ml).

Làm tròn kết quả đến hai chữ số thập phân.

11. Độ chụm

11.1. Độ lặp lại

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử, tiến hành trên cùng một nguyên liệu thử chứa từ 0,3% đến 4,0% khối lượng tinh bột, thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn độ lặp lại r_s tính được bằng công thức sau:

r_s = 0,102 + 0,132 x

trong đó:

r_s là giới hạn độ lặp lại, tính bằng phần trăm khối lượng đối với hàm lượng tinh bột không chứa nước;

là trung bình của hai kết quả đối với hàm lượng tinh bột không chứa nước.

11.1.2. Hàm lượng glucose

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng một nguyên liệu thử chứa từ 0,3% đến 1,2% khối lượng glucose, thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn độ lặp lại r_g tính được bằng công thức sau:

r_g = 0,197 + 0,070 x

trong đó:

...

...

...

là trung bình của hai kết quả đối với hàm lượng glucose.

11.2. Độ tái lập

11.2.1. Hàm lượng tinh bột không chứa nước

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử chứa hàm lượng tinh bột từ 0,3% đến 5,0% khối lượng, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn độ tái lập tính được bằng công thức sau:

R_s = 0,229 + 0,232

Trong đó:

R_s là giới hạn độ tái lập, tính bằng phần trăm khối lượng đối với hàm lượng tinh bột không chứa nước;

là trung bình của hai kết quả đối với hàm lượng tinh bột không chứa nước.

11.2.2. Hàm lượng glucose

...

...

...

R_g = 0,232 + 0,086

Trong đó:

R_g là giới hạn độ tái lập, tính bằng phần trăm khối lượng đối với hàm lượng glucose;

là trung bình của hai kết quả đối với hàm lượng glucose.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

...

...

...

- kết quả thử nghiệm thu được;

- nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Ví dụ về đồ thị và ngoại suy giá trị độ hấp thụ

Hình A.1 - Ví dụ về đồ thị và ngoại suy giá trị độ hấp thụ

...

...

...

[1] TCVN 4833-1 (ISO 3100-1), Thịt và sản phẩm thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Phần 1: Lấy mẫu

[2] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] Method No. 145 (1993). Starch and Glucose: Enzymatic Determination in Foods. Nordic Committee on Food Analysis (NMKL), Esbo, Finland (in English and Scandinavian) (UDC 577.1 - 5.08:641.13).

[5] Method No. 07.00-25(1983). Determination of Starch in Meat Products. Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Paragraph 35 LMBG (in German).

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9666:2013 (ISO 13965:1998) về Thịt và sản phẩm thịt - Xác định hàm lượng tinh bột và glucose - Phương pháp enzym