Cài đặt tốc độ dòng của hệ thống bơm gradient rửa giải (6.14.1) của hệ thống HPCL (6.14) ở tốc độ 1,00 ml/min. Cài đặt nhiệt độ của buồng cột (6.14.3) ở 40 ^oC.

Xác định thời gian cân bằng bằng cách kiểm tra độ rửa giải của cột. Tín hiệu detector ở lần chạy cuối (đường nền) cần bằng với giá trị ban đầu của nó. Rửa đẳng dòng 15 min là đủ.

8.6.3. Thể tích bơm

Sử dụng bơm tự động hoặc thủ công (6.14.2) để bơm 20 ml các dung dịch vào cột.

8.4.6. Cân bằng cột

Khi bắt đầu hệ thống trong mỗi ngày, cho 100 % dung môi rửa giải Y (8.6.1) đi qua cột trong 5 min đến 10 min. Sau đó cài đặt các điều kiện ban đầu (8.6.2) và cân bằng trong 15 min. Tiến hành chạy mẫu trắng bằng cách bơm dung dịch đệm phosphat (5.3.2).

Đối với cột bảo quản lâu, thì rửa cột bằng axetonitril (5.4.2) và nước (5.4.1) với tỷ lệ 70:30.

8.6.5. Xác định hàm lượng b-LG trong mẫu thử

Tiến hành dãy các phép phân tích sắc ký trong khi giữ ổn định thời gian chạy giữa các lần để thu được đường nền không bị trôi và thời gian lưu ổn định.

...

...

...

Nếu mẫu thử chứa hàm lượng b-LG rất thấp (ví dụ: sữa tiệt trùng, thì luôn chạy mẫu trắng (8.6.4) trước khi bơm các mẫu đó để giảm thiểu khả năng "ảnh hưởng chéo" của hệ thống. Cứ 20 đến 25 lần chạy thì làm sạch cột bằng cách cho 100 % dung môi rửa giải Y (8.6.1) đi qua cột ít nhất 30 min.

8.7. Phương pháp tích phân

Trong các điều kiện quy định, thu được ba pic b-LG không phân giải được hoàn toàn. Tích phân ba pic này theo một nhóm (Xem Hình 1). Xác định toàn bộ diện tích của các pic b-LG như sau:

Lập đường nền từ điểm bắt đầu của pic b-LG thứ nhất đến điểm cuối cùng của pic b-LG sau cùng. Tích phân diện tích của nhóm pic trong dải thời gian này (xem Hình 1 và Hình 2).

Khi các điểm bắt đầu và/hoặc kết thúc không thể nhận biết được rõ ràng vì có độ trôi đường nền hoặc hình dạng của pic không tốt, thì chấp nhận tích phân khoảng thời gian của mẫu đối chứng (xem Hình 2).

CHÚ DẪN:

X là thời gian, tính bằng phút;

Y là sự đáp ứng tương đối ở bước sóng 205 nm;

...

...

...

T là dung dịch thử với tỷ lệ pha loãng 1:5, thu được từ mẫu sữa UHT chứa 500 mg/l b-LG

R là dung dịch đối chứng với tỷ lệ pha loãng 1:50, thu được từ mẫu sữa đông khô hoàn nguyên chứa 3470 mg/l b-LG

Hình 1 - Sắc đồ HPLC của dung dịch thử sữa UHT và của dung dịch đối chứng

CHÚ DẪN:

X là thời gian, tính bằng phút;

Y là sự đáp ứng tương đối ở bước sóng 205 nm;

T là dung dịch thử với tỷ lệ pha loãng 1:2, thu được từ mẫu sữa tiệt trùng chứa 24 mg/l b-LG

R là dung dịch đối chứng với tỷ lệ pha loãng 1:100, thu được từ mẫu sữa đông khô hoàn nguyên chứa 3470 mg/l b-LG

...

...

...

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1. Hiệu chuẩn nhiều điểm

9.1.1. Tính hàm lượng b-LG, w_­x, bằng miligam trên lít có trong mỗi dung dịch đối chứng x, trong đó x = A, B, C hoặc D (8.4), theo công thức sau:

Trong đó:

m là khối lượng của b-LG, tính bằng miligam, có trong 2,5 g mẫu đối chứng (5.2).

...

...

...

A_x = (b_o x w_x) + b₁

Trong đó:

A_x là diện tích pic của b-LG của dung dịch x (x là các dung dịch từ A đến D);

b_o là hệ số hồi quy thứ nhất (độ dốc);

b₁ là hệ số hồi quy thứ hai (điểm cắt).

9.1.3. Tính hàm lượng b-LG, w_t của mẫu thử bằng miligam trên lít, theo công thức sau:

Trong đó:

A_t là diện tích pic của b-LG của dung dịch thử (8.2);

...

...

...

9.2. Hiệu chuẩn một điểm

Tính hàm lượng b-LG, w_t, của mẫu thử bằng miligam trên lít, theo công thức sau:

Trong đó:

w_r là hàm lượng b-LG trong mẫu đối chứng hoàn nguyên (8.3), tính bằng miligam trên lít;

A_r là diện tích pic b-LG của dung dịch đối chứng (8.5);

A_t là diện tích pic b-LG của dung dịch mẫu thử (8.2);

V_r là thể tích của whey axit của mẫu đối chứng hoàn nguyên (8.3) có trong 1 ml dung dịch đối chứng (8.5), tính bằng mililit;

V_t là thể tích của phần mẫu thử whey axit (8.1) đã dùng để chuẩn bị dung dịch thử (8.2), tính bằng mililit.

...

...

...

Biểu thị kết quả tính đến hai chữ số thập phân, hoặc "nhỏ hơn 15 mg/l" (xem 11.1).

10. Chuẩn hóa mẫu đối chứng

10.1. Yêu cầu chung

Định kỳ chuẩn hóa mẫu đối chứng để kiểm tra hiệu quả thực hiện của phòng thử nghiệm.

10.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn

Cân khoảng 20 mg mẫu chuẩn b-LG (5.1), chính xác đến 1 mg, cho vào bình định mức 50 ml (6.10). Hòa tan mẫu chuẩn trong dung dịch đệm phosphat (5.3.2). Pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat (5.3.2) đến vạch và trộn.

Lọc dung dịch chuẩn bằng dụng cụ lọc micro (6.11). Loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên. Thu lấy phần dịch lọc còn lại vào lọ thủy tinh (6.4).

10.3. Xác định hàm lượng protein

Xác định hàm lượng nitơ, w_N, của mẫu chuẩn theo phương pháp mô tả trong TCVN 8099-1 (ISO 8968-1) hoặc TCVN 8099-2 (ISO 8968-2).

...

...

...

w_P = w_N x 6,38

Trong đó:

w_N là hàm lượng nitơ của mẫu, tính bằng phần trăm khối lượng;

6,38 là hệ số được chấp nhận để chuyển đổi hàm lượng nitơ thành hàm lượng protein thô.

10.4. Xác định hàm lượng b-LG trong mẫu đối chứng

Chạy sắc ký cả hai dung dịch chuẩn (10.2) và dung dịch đối chứng D với tỷ lệ pha loãng 1:10 (8.4).

10.5. Tính hàm lượng b-LG

Tính hàm lượng b-LG, w_r, của mẫu đối chứng hoàn nguyên (8.3), bằng miligam trên lít, theo công thức sau:

...

...

...

m là khối lượng mẫu chuẩn (10.2), tính bằng miligam (mg);

w_{p ­}là hàm lượng protein tính trên 100 mg mẫu chuẩn, tính bằng miligam (mg);

A_s là diện tích pic b-LG của dung dịch chuẩn (10.2);

A_r là diện tích pic b-LG của dung dịch đối chứng (8.4).

Khi hệ thống làm việc tốt, thì chênh lệch giữa giá trị w_r thu được bằng quy trình này với lượng công bố trong mẫu đối chứng phải nằm trong dải quy định về độ tái lập. Những chênh lệch nhỏ có thể do nồng độ b-LG của mẫu chuẩn không tương ứng với độ tinh khiết công bố.

10.6. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả chính xác đến hai chữ số thập phân.

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

...

...

...

Giới hạn thấp nhất của phép định lượng b-LG là 15 mg/l. Dưới giới hạn đó thì biểu thị kết quả thu được là "nhỏ hơn 15 mg/l".

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ độc lập, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn:

- đối với các giá trị b-LG từ 15 mg/l đến 500 mg/l: 16 % giá trị trung bình;

- đối với các giá trị b-LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l: 4 % giá trị trung bình.

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, biểu thị độ biến thiên các kết quả phân tích độc lập thu được trong các điều kiện nói trên, không được quá 5 % trường hợp lớn hơn:

- đối với các giá trị b-LG từ 15 mg/l đến 500 mg/l: 6 %;

- đối với các giá trị b-LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l: 1,4 %.

11.3. Độ tái lập

...

...

...

- đối với các giá trị b-LG từ 15 mg/l đến 500 mg/l: 31 % giá trị trung bình;

- đối với các giá trị b-LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l: 13 % giá trị trung bình.

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, biểu thị độ biến thiên các kết quả phân tích độc lập thu được trong các điều kiện nói trên, không được quá 5 % trường hợp lớn hơn:

- đối với các giá trị b-LG từ 15 mg/l đến 500 mg/l: 11 %;

- đối với các giá trị b-LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l: 5 %.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

...

...

...

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường có thể ảnh hưởng tới kết quả.

e) kết quả thử nghiệm thu được và nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị giới hạn lặp lại và tái lập, thu được từ các kết quả của hai phép thử liên phòng thử nghiệm do Nhóm chuyên gia về sữa của Cộng đồng Châu Âu tổ chức thực hiện. Các kết quả thu được đã được phân tích thống kê phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) để cho dữ liệu về độ chụm nêu trong Bảng A.1 và A.2.

Phiếu thử thứ nhất gồm có 10 phòng thử nghiệm tham gia thực hiện trên 9 mẫu sữa UHT và sữa tiệt trùng đóng chai chứa hàm lượng b-LG từ 0 mg/l đến 500 mg/l. Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm thứ nhất được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Mẫu sữa chứa hàm lượng b-LG từ 0 mg/l đến 500 mg/l

...

...

...

Giá trị trung bình

mg/l

Giới hạn lặp lại,
r

mg/l

s_r

Giới hạn tái lập,
R

mg/l

s_R

Tiệt trùng đóng chai

...

...

...

2,64

0,94

4,82

1,72

Tiệt trùng đóng chai

24,80

3,56

1,27

9,19

...

...

...

UHT

54,30

16,01

5,72

12,72

4,54

UHT

64,90

13,89

...

...

...

20,78

7,42

UHT

80,00

32,50

11,59

36,91

13,18

UHT

...

...

...

10,07

3,60

18,57

6,63

UHT

133,70

12,04

4,22

67,03

...

...

...

UHT

240,40

31,53

11,26

57,68

20,60

UHT

424,40

38,92

...

...

...

89,49

31,96

Phép thử thứ hai gồm có 14 phòng thử nghiệm tham gia thực hiện trên 9 mẫu sữa nguyên liệu, sữa thanh trùng, sữa thanh trùng nhiệt độ cao và sữa UHT có chứa hàm lượng b-LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l. Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm thứ hai được nêu trong Bảng A.2.

Bảng A.2 - Mẫu sữa chứa hàm lượng b-LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l

Loại sữa

Giá trị trung bình

mg/l

Giới hạn lặp lại,
r

mg/l

...

...

...

Giới hạn tái lập,
R

mg/l

s_R

UHT

1337

95,12

33,97

222,52

79,47

...

...

...

1429

69,61

22,72

239,90

85,68

Thanh trùng ở nhiệt độ cao

2021

79,55

28,41

...

...

...

86,00

Thanh trùng

2557

105,15

37,55

335,80

119,93

Thanh trùng

2777

...

...

...

44,27

421,76

150,63

Thanh trùng

2920

81,51

29,11

366,35

130,84

...

...

...

3449

79,17

28,27

474,27

169,38

Nguyên liệu

3544

87,30

31,18

...

...

...

129,08

Nguyên liệu

3565

141,90

50,68

268,85

96,02

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] RESMINI, P., PELLEGRINO, L.ANDREINI R. and PRATI F. Determinazione delle sieroproteine solubii del latte per HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione) in fase inversa. Sci. Tecn. Latt. Cas., 40, 1989, pp. 7-23

[5] RESMINI, P., PELLEGRINO, L.HOGENBOOM J.A. ANDRENIN R. Thermal denaturation of whey protein in pasteurizes milk. Fast evaluation by HPLC. Ital. J. Food Sci.,2, 1989, pp. 51-62

1) Cột PLRP-S là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Polymer laboratories Ltd, Church Stretton, Vương quốc Anh.

Thông tin đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

2) Tương đương với IDF 50.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9660:2013 (ISO 13875 : 2005) về Sữa dạng lỏng - Xác định hàm lượng β-lactoglobulin tan trong axit -Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo